论文部分内容阅读
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物,包括丹酚酸和丹参酮两类活性成分,对心脑血管疾病的治疗有显著的疗效。了解丹参中次生代谢通路及调控机制对认识丹参品质形成具有重要作用。目前关于丹参次生代谢调控的研究主要集中在这几方面:控制酶基因的表达量来改变次生代谢物的积累;施加生物或非生物诱导因子来刺激次生代谢物的产生;利用转录因子调控次生代谢物的生物合成等。有关酶基因的功能鉴定已有大量的报道,但在诱导因子的作用机理和转录因子的调控机制方面还待完善。已有研究表明茉莉素（JA）是丹参次生代谢调控的诱导因子,施加茉莉酸甲酯（MeJA）后能够影响JA信号通路相关成员的表达,激活相关合成途径的酶基因,促进次生代谢产物的合成,但是具体的信号通路和作用机制尚不明确。参考其他物种中JA信号的作用机制,结合前期数据,我们发现丹参中JAZ蛋白和bHLH、MYB、WRKY类转录因子在应答茉莉素信号过程中发挥着重要的作用,JAZ蛋白与这些转录因子的结合是茉莉素实现生理功能的分子基础。因此,鉴定与JAZ蛋白互作的转录因子,探讨JAZ蛋白对转录因子调控作用的影响,有助于阐明JA信号诱导丹参次生代谢产物积累的分子机制。主要的研究内容和结论如下:1.基于前期的转录组学和基因信息分析,我们筛选到三条可能参与丹参次生代谢的MeJA响应基因SmbHLH59、SmMYB97和SmWRKY14。利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术对三条转录因子和丹参JAZ蛋白进行互作分析。结果发现:SmbHLH59 与 SmJAZ1 和 SmJAZ8 互作,SmMYB97 和 SmJAZ8 互作,SmWRKY14与SmJAZ1、SmJAZ3以及SmJAZ8均可以结合,这提示我们JAZs-TFs可能作为转导单元介导丹参中JA信号的调控。2.从丹参中鉴定出一条bHLH类转录因子SmbHLH59。生物信息学分析显示SmbHLH59属于Ⅲe亚家族,该家族成员在JA信号通路中协同发挥正调控作用。表达模式分析发现SmbHLH59在丹参叶中高表达且积极响应MeJA处理。借助Gateway技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建了SmbHLH59过表达和敲除载体,利用农杆菌介导的叶盘转化法获得了SmbHLH59过表达和敲除株系。次生代谢物和关键酶基因检测结果表明:过表达SmbHLH59显著提高了丹酚酸和丹参酮的含量,并激活了丹酚酸和丹参酮生物合成途径的关键基因,特别是SmPAL1、SmC4H1、SmHPPR1、SmCPS1和SmKSL1。敲除株系中抑制了丹酚酸和丹参酮的积累,多数关键酶基因的表达也出现了下调。随后我们通过酵母单杂交和瞬时激活实验证实了 SmbHLH59通过结合E/G-box元件激活SmPAL1、SmC4H1、SmHPPR1、SmCPS1和SmKSL1启动子。所以,SmbHLH59作为正调控因子通过结合并激活靶基因启动子来促进丹参的次生代谢的积累。3.我们对JA应答基因SmMYB97进行了鉴定和分析。多序列比对和系统发育树分析显示SmMYB97与AtMYB11、AtMYB12、ZmP1和ZmP2聚集在调节黄酮醇生物合成的SG7亚家族中。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析发现SmMYB97在丹参叶片中表达量最高,并受到MeJA的诱导。基因功能研究发现SmMYB97过表达促进了丹酚酸和丹参酮的生物合成,并上调了SmPAL1、SmTAT1、SmCPS1和SmKSL1等关键酶基因的表达。此外SmMYB97可以结合MBS/MRE元件并增强SmPAL1、SmTAT1、SmCPS1和SmKSL1启动子的活性,是丹参次生代谢调控的激活子。4.通过筛选MeJA处理后SmCOI1干涉株系和野生型株系的转录组数据,我们发现了一个依赖SmCOI1的JA响应基因Sm WRKY14。生物信息学和表达模式结果显示SmWRKY14属于Ⅱc亚家族并且在根中表达量最高,而且还受到MeJA的诱导。结果显示SmWRKY14过表达株系中丹酚酸和丹参酮的含量显著高于野生型,相应的生物合成途径的关键基因也被激活,其中丹酚酸合成途径的SmPAL1、SmC4H1、SmTAT1和SmRAS1基因和丹参酮生物合成途径的SmCPS1基因被诱导表达,说明这五条基因可能是SmWRKY14调控丹酚酸和丹参酮合成的靶基因。进一步分析发现SmWRKY14可以通过W-box元件结合并激活SmPAL1、SmC4H1、SmTAT1、SmRAS1和SmCPS1的启动子,进而调控靶基因的表达,使丹酚酸和丹参酮的积累增加。5.利用瞬时激活研究SmJAZ蛋白对转录因子激活活性的影响。与对照相比,SmbHLH59或SmMYB97均能激活靶基因启动子的活性,SmJAZs不会影响启动子的活性,但SmJAZs与SmbHLH59或SmMYB97共同注射烟草时,靶基因启动子的活性显著降低。这说明SmJAZs蛋白抑制了 SmbHLH59和SmMYB97转录因子对靶基因启动子的激活活性。我们认为丹参JAZs蛋白的作用机制是通过与SmbHLH59或SmMYB97转录因子互作,削弱转录因子对靶基因启动子的激活活性,进而下调靶基因在转录水平的表达量,最终抑制丹酚酸和丹参酮的生物合成。综上所述,我们对JA诱导的三条转录因子SmbHLH59、SmMYB97和SmWRKY14在丹参次生代谢过程中的调控作用和机理进行分析,并且初步阐述了JAZs-TFs作为JA信号转导单元介导丹参次生代谢调控的分子机制,为进一步了解丹参次生代谢产物合成研究提供资料。