目的:A族链球菌(Group A streptococcus,GAS),是一种人类特异性致病菌,又称化脓性链球菌,它通过飞沫、皮肤接触传播,在全球分布广泛。GAS既能引起咽喉炎、脓疱病等较轻的感染,也能引起风湿性心脏病、关节炎、肾小球肾炎等后遗症,还会导致败血症、链球菌中毒休克综合症等严重疾病。皮肤和上呼吸道是GAS最常寄居的部位,>20%儿童是无症状带菌者,全球每年大约有50万人死于链球菌感染性疾病。虽然链球菌仍然对抗生素敏感,但耐药的报道也在不断增加。因此,近一百年来人们一直在寻找能有效预防链球菌的疫苗,但很遗憾,目前仍然没有一个安全有效的疫苗用于临床。近年来,人们应用互补基因组技术在GAS表面筛选了一些细菌表面抗原,有些已经通过动物实验验证有一定的免疫保护作用。Spy0747是链球菌表面的一种DNA酶,因为它和猪链球菌表面DNA酶SsnA具有同源性,并且其活性的发挥都需要Ca2+和Mg2+,所以Spy0747又被称为SpnA。SpnA在目前已知的链球菌种群中有很广泛的分布,它能诱导产生相应的抗体,在核酸实验中,这些抗体能够抑制SpnA的活性,并且SpnA的基因突变缺失型菌株的毒力明显下降,这说明SpnA具有开发疫苗的潜力。本研究扩增了SpnA蛋白的编码基因,并连接到真核表达质粒上制成核酸疫苗,通过动物实验来验证该疫苗的有效性。方法:(1)引物设计:本实验的目的基因为Spy0747基因,其引物用primer premier 5.0软件进行设计,经PCR方法扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化。(2)PGEM-T/Spy0747构建:PCR扩增产物与PGEM-T vector连接,转化基因工程菌E.coli DH5α,并构建克隆载体,在设计的酶切位点处用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切并电泳鉴定,之后测序鉴定。(3)pcDNA3.l/Spy0747构建:回收克隆载体上Spy0747的片段,连接于pcDNA3.1载体,它们预先经同样的酶切回收。构建的重组质粒为真核表达质粒,经鉴定后-20℃保存待用。(4)质粒大提:真核质粒转化到E.coli DH5α,用碱裂解法大量制备重组质粒pcDNA3.l/Spy0747。(5)免疫小鼠:本研究将小鼠分为2组,每组20只,分别为pcDNA3.l/Spy0747质粒免疫组和pcDNA3.1空质粒对照组,免疫部位为小鼠后肢大腿肌肉注射,第一次免疫后,每隔两周进行下一次免疫,共免疫3次。(6)免疫指标:每次免疫后两周处死小鼠(每组3只),剩余小鼠继续免疫分析。分析指标是用Real-time PCR方法检测脾脏细胞因子IL-4、IL-12 mRNA表达情况。(7)末次免疫后两周用致死量GAS攻击小鼠,记录小鼠两周内的生存情况,绘出生存曲线。(8)致死量GAS攻击小鼠后三天,每组处死1只小鼠,取心、肺、肝、脾,经HE染色,切片观察对组织的免疫保护效果。结果:(1)用PCR方法成功扩增了Spy0747基因。(2)成功构建了PGEM-T/Spy0747原核表达质粒和pcDNA3.l/Spy0747真核表达质粒。(3)Real-time PCR结果显示:第二次免疫结果与对照组比较,pcDNA3.l/Spy0747免疫组的IL-4,IL-12水平有统计学差异(P<0.05)。病理结果显示:疫苗接种后,各个实验组小鼠的组织病理切片(包括心脏、肝脏、肺脏、脾脏)均未见异常。致死量细菌攻击之后,小鼠心肌细胞大小不等;肝细胞嗜酸性增强,大量炎细胞浸润,肝细胞核大小不等,轻度水肿变性;肺泡间局部可见淋巴细胞浸润;脾细胞未见异常。(4)致死量攻击后,两组小鼠在观察期内均全部死亡,免疫组与对照组相比未显示出明显的保护效果。结论:(1)真核表达质粒pcDNA3.l/Spy0747基因疫苗构建成功。(2)小鼠免疫后,比较实验组和对照组的细胞因子表达变化,IL-4、IL-12mRNA水平有差异,说明小鼠的细胞免疫和体液免疫均有增加的变化;致死量细菌攻击后,免疫组显示出一定的保护效果,但pcDNA3.l/Spy0747的免疫保护效果并不十分理想。