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背景越来越多的研究证实高危型人乳头瘤病毒(High risk human papilloma-viruses, HR-HPVs),尤其是HPV16与宫颈癌发生与演进有密切的病因学关系,E6和E7两个病毒癌蛋白的持续表达是其诱发肿瘤和维持其恶性表型的关键,另外,E6和E7是源于HPVs病毒基因组,仅存在于感染HPVs的细胞中,是基因治疗的理想作用靶点。转录激活效应因子核酸酶(Transcription activator-like effectors nucleases, TALEN)是一种崭新的基因工程技术,可避免RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术干扰不完全,稳定性差等缺陷。本研究通过TALEN技术敲除HPV16E6/E7,观察宫颈癌CaSki细胞的各种生物学行为改变。目的研究利用TALEN技术靶向敲除HPV16E6/E7对CaSki细胞恶性行为的影响,试图阐明通过TALEN技术定点敲除HPV16E6和E7在HPV相关宫颈癌治疗中的可行性,为临床治疗宫颈癌提供新的线索和科学依据。方法1.以HPV16阳性宫颈癌CaSki细胞为研究对象,根据TALEN质粒设计原则分别设计靶向HPV16E6和E7的TALEN左臂和右臂,并按照TALEN质粒试剂盒操作说明书制备HPV16E6和E7的TALEN左臂和右臂,分别命名为HPV16E6-L、HPV16E6-R和HPV16E7-L、HPV16E7-R。2.通过脂质体介导将TALEN空质粒转染入HPV16阳性的人宫颈癌CaSki细胞,同理将重组质粒HPV16E6-L、HPV16E6-R转染入HPV16阳性的人宫颈癌CaSki细胞,嘌呤霉素筛选抗性细胞,挑取5个单克隆并扩增。通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)筛选出敲除HPV16E6的细胞克隆,再将HPV16E7-L、HPV16E7-R共转入一个筛选出的细胞克隆中,通过倍比稀释法挑选5个单克隆并扩增,再次通过RT-RCR筛选出同时敲除HPV16E6及E7的细胞克隆。并通过Western blotting方法检测细胞中E6/E7蛋白水平的表达。3.通过绘制生长曲线、平板克隆实验、流式细胞术、Annexin V-FITC/PI结合流式细胞术、Caspase3活性测定和Transwell等实验探讨利用TALEN技术敲除HPV16E6/E7表达对宫颈癌CaSki细胞增殖、凋亡和迁移及侵袭能力的影响。结果1.转染HPV16E6-L和HPV16E6-R的CaSki细胞及转染TALEN空质粒的CaSki细胞分别命名为：CaSki-TALEN-vect细胞和CaSki-TALEN-E6细胞。RT-PCR结果显示,5个CaSki-TALEN-E6细胞克隆中,克隆2和克隆5不表达E6mRNA。将HPV16E7-L和HPV16E7-R共转染入E6被敲除的CaSki-TALEN-E6细胞克隆5,倍比稀释法挑选5个单克隆,RT-PCR结果显示,5个细胞克隆中,克隆1不表达E7mRNA,命名为CaSki-TALEN-E6/E7细胞。Western blotting方法检测CaSki细胞、CaSki-TALEN-vect细胞和CaSki-TALEN-E6/E7细胞中E6和E7在蛋白水平的表达的结果显示：CaSki细胞和CaSki-TALEN-vect细胞中E6和E7蛋白均表达,且差异无显著性(P>0.05)。CaSki-TALEN-E6/E7细胞中E6和E7蛋白均不表达。鉴于以上研究结果,后续实验中均以CaSki-TALEN-E6/E7细胞为实验组,以CaSki-TALEN-vect细胞为对照组。2.敲除HPV16E6/E7对宫颈癌CaSki细胞恶性行为的影响(1)对宫颈癌CaSki细胞增殖的影响：①MTT比色法绘制细胞生长曲线并计算倍增时间的结果显示：与CaSki-TALEN-vect细胞相比,CaSki-TALEN-E6/E7细胞生长速度明显减慢(P<0.01),倍增时间显著延长(P<0.01)。②平板克隆形成实验的结果显示：CaSki-TALEN-E6/E7细胞克隆形成均数明显低于CaSki-TALEN-vect细胞(P<0.01),且克隆体积明显较小。③流式细胞术分析细胞周期分布的结果显示：与CaSki-TALEN-vect细胞相比,CaSki-TALEN-E6/E7细胞G1期细胞增加(P<0.01),但S期细胞明显减少(P<0.01),出现G2/M期阻滞(P<0.01)。(2)对宫颈癌CaSki细胞凋亡的影响：①Annexin V-FITC/PI结合流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示：与CaSki-TALEN-vect细胞相比,CaSki-TALEN-E6/E7细胞细胞凋亡均数明显升高(P<0.01)。②Caspase-3活性测定结果显示：与CaSki-TALEN-vect细胞相比,CaSki-TALEN-E6/E7细胞中Caspase-3活性显著增加(P<0.01)。(3)对宫颈癌CaSki细胞迁移和侵袭能力的影响：Transwell迁移和侵袭实验的结果均显示：与CaSki-TALEN-vect细胞相比,CaSki-TALEN-E6/E7细胞穿过小室底膜的细胞数显著减少(P<0.01)。结论1.成功构建了可敲除HPV16E6和E7的TALEN真核重组表达质粒并筛选出敲除HPV16E6和E7的细胞克隆。2.敲除HPV16E6和E7对宫颈癌CaSki细胞恶性行为的影响包括：①抑制宫颈癌CaSki细胞增殖,②促进宫颈癌CaSki细胞凋亡,③降低宫颈癌CaSki细胞迁移和侵袭的能力。