脑胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤,临床上总是根据WHO分级对其进行治疗及预后判断。目前国内外较一致的治疗方案是手术切除病灶(兼顾生命安全及神经功能的前提下最大范围的手术切除),而后辅助替莫唑胺等药物化疗和(或)放射治疗。近些年,在胶质瘤手术治疗、放疗以及药物化疗等方面均取得了很大的进步,也有很多研究结果提示手术治疗联合放化疗的确使得不少胶质瘤患者受益,生活质量提高了,生存期延长了。但对于高级别胶质瘤患者总体预后并无明显改善。由于胶质瘤的高度恶性,浸润性生长,易于复发,与周围正常脑组织没有明显分界,故目前临床疗效仍不理想,相当多的胶质瘤患者在积极治疗后的24个月内死亡。目前研究发现,胶质瘤随着生长年限的增加,其恶性程度会逐渐增加,随着复发次数的增加其恶性程度也会不断增加。因此,脑胶质瘤仍是医学领域复杂性、难治性疾病之一,目前针对胶质瘤的研究主要集中在对其病因学、发病机理的研究,以及新的有效治疗手段方面。PTTG1基因在大多数恶性肿瘤及内分泌相关性肿瘤中均有较高表达,目前研究认为PTTG1基因与抑制染色体分离密切相关,还参与了血管生成,在肿瘤的发生发展及侵袭转移中起到重要作用。目前,国内外在胶质瘤研究中以PTTG1基因为研究对象及治疗靶点的报道较少。因此,为了研究PTTG1基因在胶质瘤发生中的作用,探讨靶向RNA干扰PTTG1基因在胶质瘤治疗中的可行性,本研究应用免疫组化法观察在脑胶质瘤组织中PTTG1基因的表达情况以及PTTG1基因与临床病理之间的关系,最后我们体外培养了人胶质瘤细胞系U373及LN-229细胞,利用RNA干扰技术使得PTTG1基因表达沉默,观察其对人胶质瘤细胞侵袭、增殖、凋亡以及替莫唑胺(TMZ)化疗敏感性的影响,并探讨其可能的作用机制。本研究总体分为三部分：1.人脑胶质瘤中PTTG1的表达和临床病理相关性分析目的：探讨人脑胶质瘤组织中PTTG1的表达情况,检测脑胶质瘤细胞系中PTTG1蛋白的表达情况,探讨PTTG1与临床病理特征的关系,为后续研究做准备。方法：收集2012年9月至2014年8月期间,内蒙古医科大学附属医院及南方医科大学附属南方医院神经外科收治的80例脑胶质瘤患者的临床样本,其中男性患者48例,女性32例,年龄35-68岁,中位年龄47岁,另外收集了10例颅脑外伤患者的正常脑组织样本作为对照。按照2007年WHO对中枢神经系统肿瘤的分级与分类,将所有纳入实验的病人分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级组,四组病例数分别为10例、20例、25例和25例。所有胶质瘤患者均为首次手术,在手术前均未接受任何放化治疗。采用免疫组化、RT-PCR及Western blot方法分别检测人脑胶质瘤细胞中PTTG1的表达情况。结果：免疫组化结果显示,PTTG1阳性表达主要定位于肿瘤细胞的胞浆,在细胞内呈弥漫性分布,少量定位于细胞核,PTTG1在胶质瘤中的表达较正常脑组织明显上调。80例胶质瘤标本中,26例无PTTG1表达,24例为低表达,30例呈高表达,阳性表达率为67.50%,而在正常对照组中,9例无PTTG1表达,仅有1例为低表达,阳性表达率为10.00%,PTTG1在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.01),并且PTTG1的表达量随着病理分级的增高而增加。RT-PCR检测结果显示,与正常脑组织相比,胶质瘤组织样本中PTTG1 mRNA水平上调(4.37±0.58 vs 1.00±0.22,P=0.003),两者具有统计学差异。Western blot检测结果表明,胶质瘤组织样本中PTTG1的蛋白水平明显高于正常脑组织。结论：PTTG1在人脑胶质瘤组织中表达明显升高,PTTG1的表达量与胶质瘤的病理分期关系密切。2. PTTG1 siRNA表达载体构建及其对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响目的：构建针对人脑胶质瘤细胞系的高效沉默PTTG1的RNAi载体；探讨PTTG1 shRNA干扰质粒对人脑胶质瘤细胞系U373及LN-229增殖、侵袭性的影响。方法：设计三对PTTG1基因干扰序列,合成能够特异干扰PTTG1的siRNA,然后将其与pGenesil2载体连接,形成pGenesil2-PTTG1 siRNA,即构建成三个针对PTTG1的干扰载体,同时构建PTTG1过表达质粒,并在脂质体作用下将PTTG1 siRNA质粒和PTTG1过表达质粒分别转染至胶质瘤U373和LN-229细胞后,用RT-PCR和Western blot方法检测PTTG1 mRNA及蛋白表达水平的变化。通过细胞增值实验、划痕实验和Transwell小室实验检测PTTG1对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,并用RT-PCR和Western Blot方法检测与胶质瘤细胞增殖、侵袭相关的MMP2、VEGF表达情况。结果：在胶质瘤U373细胞转染3个不同的siRNA片段干扰PTTG1的表达,RT-PCR检测结果显示,PTTG1 siRNA1的干扰效率最高(0.47±0.12 vs1.00±0.15,P<0.01),因此后续的实验选用PTTG1 siRNA1干扰片段来进行。转染PTTG1 siRNA质粒的胶质瘤细胞U373在48和72 h细胞增殖能力均显著低于对照组。细胞划痕实验显示干扰PTTG1可明显缩短U373细胞的迁移距离；Transwell小室结果提示干扰PTTG1后U373的穿膜细胞数明显减少(59.4±7.1 vs30.2±4.7p<0.05)o RT-PCR结果显示：当PTTG1表达下调后,胶质瘤细胞表达的MMP2和VEGF明显减少(0.35±0.06 vs 1.00±0.12 p<0.001; 0.53±0.08 vs 1.00±0.09 p<0.01), Western blot的检测结果与RT-PCR结果相一致。结论：成功构建了能够高效沉默PTTG1基因的RNAi表达载体,该载体不仅高效地抑制了U373细胞中PTTG1的表达：还抑制了胶质瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力。3. RNAi沉默PTTG1对人脑胶质瘤细胞凋亡、化疗敏感性的影响及可能机制目的：探讨PTTG1 shRNA干扰质粒对U373细胞体外细胞凋亡、化疗敏感性的影响以及可能的机制。方法：在脂质体作用下将PTTG1干扰质粒转染至U373细胞,通过MTT法观察细胞的增殖变化(转染后24 h、48 h以及72 h);并与替莫唑胺(temozolomide, TMZ)联合作用于胶质瘤U373细胞,再通过MTT比色法和流式细胞仪分别检测细胞增殖及细胞凋亡。通过RT-PCR和Western blot方法分别检测凋亡相关信号通路中PI3K、P-PI3K、Akt和p-Akt蛋白的表达。结果：RNAi沉默PTTG1基因后,U373细胞生长速度显著减慢,凋亡增加；转染PTTG1 siRNA质粒的U373细胞组与加入400umol/L替莫唑胺细胞组的增殖能力均较对照Scramble组低,并且PTTG1 siRNA质粒与替莫唑胺联合可进一步抑制胶质瘤细胞增殖。流式细胞仪检测细胞凋亡显示与scramble组比较,应用替莫唑胺组及PTTG1 siRNA组细胞凋亡增加,组间差异有统计学意义(P<0.05),而且PTTG1 siRNA协同TMZ对细胞凋亡的促进作用更加明显。Western blot结果显示：在胶质瘤细胞U373中转染PTTG1干扰质粒后p-PI3K和p-Akt表达量明显下降,而对PI3K和Akt表达水平无明显影响。结论：PTTG1基因与脑胶质瘤密切相关,在胶质瘤的发生、发展及侵袭过程中起了关键作用。本研究构建的PTTG1干扰载体,的确能够高效特异地抑制U373细胞体外增殖侵袭能力,促进了细胞凋亡。并且PTTG1 siRNA质粒与替莫唑胺(TMZ)联合可进一步抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡,增加了TMZ对胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性。PTTG1 siRNA抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡的作用可能是通过PI3K/AKT信号通路实现的。综上所述,本研究提示：PTTG1基因与脑胶质瘤密切相关,检测PTTG1基因及其表达产物可以对胶质瘤的恶性程度做出初步判断,在胶质瘤的诊断、治疗方面意义较大。PTTG1可通过促进MMP2、MMP9的表达,促进胶质瘤的血管生成,促进胶质瘤细胞侵袭增殖;通过PI3K/AKT通路调节凋亡相关因子的表达,抑制胶质瘤细胞的凋亡。应用RNA干扰PTTG1再联合替莫唑胺能够增加胶质瘤对替莫唑胺的敏感性,为胶质瘤的预后评估及治疗提供新策略。