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β-丙氨酸是自然界存在的唯一一种β型氨基酸。虽然是一种非蛋白质氨基酸,但在医药、食品、化工、环境等领域都有广泛应用,可用于制备高附加值的医药中间体。目前,β-丙氨酸的工业生产方法通常使用丙烯腈作为起始物,通过化学催化氨化后生成。但此方法转化率低,副产物多,不利于后期分离提纯,极大限制了这种高附加化学品的规模制备。相比之下,酶转化法制备β-丙氨酸副产物极低,具有重要的应用前景,有望全面替代化学法制备β-丙氨酸。然而,通过单一酶法直接转化L-天冬氨酸制备β-丙氨酸的成本较高,因此,构建多酶催化系统,实现从低价值底物多步转化生成β-丙氨酸对提高目标产物的产率,降低生物转化成本具有重要意义。基于此,本论文通过将天冬氨酸酶(L-Aspartase,EcAspA)和L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-Aspartateα-decarboxylase,ADC)置于同一体系中,构建出了双酶催化体系实现两步生产β-丙氨酸,以价格较为低廉易得的富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸,缩短反应时间。主要研究结果如下:(1)成功表达了大肠杆菌(Escherichia coli)中编码L-天冬氨酸酶的EcaspA基因和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶的CgpanD基因,构建出EcAspA-CgADC一釜双酶催化体系。经过检测,催化反应中EcAspA与CgADC的最适加酶比例为1:80,其中EcAspA的浓度为10μg·m L-1,转化温度为37°C,pH为7.0;浓度为100 mmol·L-1的富马酸可在8 h内被完全转化,摩尔产率为90.9%,β-丙氨酸的产量为90 mmol·L-1,约合7 g·L-1;浓度为200 mmol·L-1的富马酸在反应8 h后,体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol·L-1,约合9.8 g·L-1。(2)将赤拟谷盗(Tribolium castaneum)来源的TcpanD基因克隆入pET28a(+)载体,实现在E.coli BL21(DE3)中重组表达TcADC,用His-Trap和Resource Q两步纯化得到电泳纯的重组蛋白。酶学性质表明,重组TcADC的最适温度为37°C,最适pH为6.5,比酶活为350 mmol·g-1·h-1(350 U·g-1),Vmax为0.0813 mmol·min-1,转化数kcat为3.9 s-1。(3)用TcADC替换CgADC,构建出EcAspA-TcADC一釜双酶催化体系,该体系最适反应pH为6.5;催化200 mmol·L-1富马酸完全转化的时间为12 h,β-丙氨酸的摩尔浓度为192 mmol·L-1,约15 g·L-1;增加底物富马酸浓度至400 mmol·L-1,12 h后,富马酸完全转化为L-天冬氨酸和β-丙氨酸,其中β-丙氨酸的摩尔浓度为334 mmol·L-1,延长反应时间至24 h,β-丙氨酸的摩尔浓度为340 mmol·L-1,约26.5 g·L-1。