【摘 要】
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目的:探讨宫颈癌患者血清mi R-101-3p的表达及其临床意义,以及mi R-101-3p靶向Ras相关C3肉毒素底物（Rac1）在宫颈癌细胞丝状伪足形成中的调控作用。方法:1.采用q RT-PCR法检测30例宫颈癌患者和30例健康体检者血清mi R-101-3p的表达量;2.上调mi R-101-3p后采用双荧光素酶报告基因实验验证mi R-101-3p与Rac1的靶向关系、通过Western
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目的:探讨宫颈癌患者血清mi R-101-3p的表达及其临床意义,以及mi R-101-3p靶向Ras相关C3肉毒素底物（Rac1）在宫颈癌细胞丝状伪足形成中的调控作用。方法:1.采用q RT-PCR法检测30例宫颈癌患者和30例健康体检者血清mi R-101-3p的表达量;2.上调mi R-101-3p后采用双荧光素酶报告基因实验验证mi R-101-3p与Rac1的靶向关系、通过Western-blot、q RT-PCR和免疫荧光法检测Rac1的表达水平;3.通过si RNA、免疫共沉淀和免疫荧光法检测Rac1与Cdc42蛋白的相互作用;4.采用Cdc42活性抗体检测试剂盒检测Cdc42蛋白活性;Western-blot、q RT-PCR法检测Cdc42下游信号通路蛋白NWASP、Arp2/3的表达水平及磷酸化水平;通过免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察F-actin在细胞内聚合情况、采用扫描电镜观察各组细胞丝状伪足情况。结果:1.q RT-PCR检测结果显示:与健康体检者组相比,宫颈癌患者组血清mi R-101-3p表达明显降低（P＜0.01）;mi R-101-3p低表达的宫颈癌患者分化程度低（p=0.001）,有淋巴结转移（p=0.024）;2.双荧光素酶报告基因实验结果显示:与对照组相比,转染mi R-101-3p mimic组的野生型和突变型Rac1报告荧光表达明显降低（P＜0.05）,提示mi R-101-3p与Rac1有结合作用;Westernblot、q RT-PCR结果显示,与NC mimic组相比,mi R-101-3p mimic组Rac1基因与蛋白表达显著下调（P＜0.05）;免疫荧光结果显示,Rac1分布于细胞膜,与NC mimic组相比,mi R-101-3p mimic组Rac1蛋白荧光表达明显降低（P＜0.05）。3.si RNA实验结果显示:与对照组相比,si-Rac1组Rac1蛋白表达明显降低（P＜0.05）、si-Cdc42组Cdc42蛋白表达明显降低（P＜0.05）;与对照组相比,si-Rac1组Cdc42蛋白在24h、48h、72h蛋白表达明显降低（P＜0.05）,si-Cdc42组Rac1蛋白在24h、48h、72h蛋白表达明显降低（P＜0.05）;免疫共沉淀结果显示:Rac1与Cdc42蛋白有相互作用（P＜0.05）;免疫荧光结果显示:Rac1与Cdc42均分布于细胞膜,并部分结合。4.Cdc42活性抗体检测显示:与NCmimic组相比,mi R-101-3pmimic组、mi R-101-3p mimic+Rac1组、mi R-101-3pmimic+PDGF组Cdc42蛋白活性降低（P＜0.05）;与mi R-101-3pmimic组相比,mi R-101-3pmimic+PDGF组Cdc42蛋白活性升高（P＜0.05）;Western-blot结果显示:与NCmimic组相比,mi R-101-3pmimic组NWASP、p NWASP、Arp2/3、p Arp2、p Arp3蛋白表达降低（P＜0.05）,mi R-101-3pmimic+Rac1组、mi R-101-3pmimic+PDGF组NWASP、p NWASP、Arp2/3、p Arp2、p Arp3蛋白表达升高（P＜0.05）、F-actin蛋白表达无明显变化;q RT-PCR结果显示:与NCmimic组相比,mi R-101-3pmimic组NWASP、Arp2/3基因表达降低（P＜0.05）,mi R-101-3p mimic+Rac1组、mi R-101-3pmimic+PDGF组NWASP、Arp2/3基因表达升高（P＜0.05）,F-actin无显著差异（P＞0.05）;免疫荧光和共聚焦显微镜观察:相同激发光下,与NCmimic组相比,mi R-101-3pmimic组F-actin蛋白荧光表达降低,丝状伪足明显减少（P＜0.05）、mi R-101-3p mimic+Rac1组、mi R-101-3pmimic+PDGF组F-actin蛋白荧光表达升高,丝状伪足明显增多（P＜0.05）;扫描电镜结果显示:与NCmimic组相比,mi R-101-3pmimic组丝状伪足数减少（P＜0.05）,mi R-101-3p mimic+Rac1组、mi R-101-3pmimic+PDGF组丝状伪足数无明显变化（P＞0.05）。结论:1.血清mi R-101-3p水平可以作为判断宫颈癌预后的备选分子指标,但还需今后扩大样本量和补充随访资料进一步研究。2.mi R-101-3p通过靶向Rac1以及Cdc42及其下游细胞骨架信号通路调控宫颈癌细胞丝状伪足的形成。
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