本研究由吉林省科技发展计划项目（2013010267JC）——“酶固定化中活性中心的构象保护及其在玉米肽制备中的应用研究”课题资助。以提高胰蛋白酶固定化性能为目的，针对目前的胰蛋白酶固定化技术所存在的缺陷，提出了“锁闭-固定化-激活”的固定化酶战略技术，来减少或避免固定化过程中胰蛋白酶活性构象的损伤。实验以胰蛋白酶的固定化为研究载体，选取抑肽酶、KTI和BBI三种生物抑制剂为锁闭因子，借助荧光猝灭法、同步荧光光谱法、紫外光谱法、CD圆二色谱法等研究手段，通过比较三种锁闭因子与胰蛋白酶相互作用过程中对胰蛋白酶的猝灭效应、二级结构和活性的影响，筛选出表现优秀的抑制剂——抑肽酶作为锁闭因子进行固定化前胰蛋白酶活性中心的锁闭。选取APTES对SBA-15介孔材料进行氨基修饰，对锁闭的胰蛋白酶（锁闭酶）进行固定化。对固定化过程中的操作条件进行了优化，并探究了固定化锁闭酶的pH稳定性和温度稳定性。选取三种不同的洗脱液作为激活剂对固定化之后的锁闭酶进行洗脱激活，探究了洗脱过程中的操作条件及洗脱后固定化胰蛋白酶的稳定性，以确保固定化酶的有效活性。（1）当酶和抑制剂的浓度比合适时，三种抑制剂对胰蛋白酶的荧光猝灭效应都比较显著。对荧光猝灭Stern–Volmer曲线进行分析得出：三种抑制剂与胰蛋白酶均以1:1的摩尔比结合成稳定的复合物，结合热力学参数的计算结果，可以知道，这种结合都是自发的。这就为以后的胰蛋白酶的锁闭及固定化之后的激活奠定了基础。（2）同步荧光和紫外光谱的结果均显示，抑肽酶对胰蛋白酶的抑制效果最显著。CD圆二色谱进一步分析了三种抑制剂对胰蛋白酶二级结构的具体影响，得出总体影响抑肽酶影响最大，BBI次之，KTI最小。以BAEE为底物，测定三种抑制剂对胰蛋白酶活性的影响。随着抑制剂浓度的增加，三种抑制剂对胰蛋白酶活性的影响程度依次为：抑肽酶>BBI>KTI。抑制剂浓度较高时，反应时间对胰蛋白酶活性的抑制作用明显，其中，反应时间对胰蛋白酶与KTI的反应影响最为明显。综合比较得出，选取抑肽酶作为胰蛋白酶的锁闭因子。（3）以重蒸甲苯为溶剂，用APTES对SBA-15进行氨基改性，改性后介孔材料对锁闭的胰蛋白酶进行固定化。XRD、N2吸附脱附等温线法以及傅里叶红外光谱对氨基改性的SBA-15进行了表征。又利用傅里叶红外光谱对固定化的胰蛋白酶进行表征，结果显示胰蛋白酶被成功地固定在了氨基改性的SBA-15上。固定化操作条件的优化结果显示，固定化时间为3h，pH为8左右时，酶的固载量最高，达到619.854ug/mg。这些参数可以为固定化锁闭酶在实际操作中提供理论指导。（4）以洗脱液中的蛋白质含量以及抑肽酶的抑制剂活性为指标，优化了作为激活剂的洗脱液种类及洗脱流速对抑肽酶洗脱结果的影响。选取三种不同的洗脱液作为洗脱剂激活固定化锁闭酶。（1）0.01M pH为3的HCl溶液；（2）0.1M pH7.5的硼酸缓冲液、0.25MpH4.5的醋酸铵-醋酸缓冲液以及0.5M pH1.5的醋酸钠-盐酸缓冲液；（3）1M NaCl、0.01M CaCl2和15%异丙醇的0.01M pH分别为5、4、3、2的HCl溶液。优化结果显示，第三种洗脱液对抑肽酶的洗脱效果最好。且流速为1.5mL·min-1时洗脱的抑肽酶的抑制活力最高。锁闭的胰蛋白酶被氨基修饰的SBA-15固定化再激活之后，温度稳定性和pH稳定性不仅较游离酶有很大提高，相对于SBA-15直接固定化的胰蛋白酶，稳定性都有较大提高。