[背景与目的]随着医疗技术的进步,癌症的早期诊断取得了长足的进步。肝细胞癌作为一种在亚洲和非洲具有高发生率、高死亡率的恶性肿瘤,其早期诊断仍然相对困难。绝大多数患者在诊断时均处于疾病中晚期,而诊断延迟导致患者错过手术时机,并由此导致肝细胞癌的高死亡率。而目前主要的早期肝癌筛查手段局限于血清甲胎蛋白(AFP)和影像学检查,其应用虽然取得了比较好的早期诊断效果,但是二者敏感度和特异度相对较低,在应用中也存在不少缺陷。目前陆续有研究表明microRNA参与了肝细胞癌的发生与发展过程。因此有必要对microRNA在肝细胞癌中的诊断价值进行进一步研究。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,肝癌的发生发展过程是一个多因素,多步骤的复杂演变过程。microRNA是一种非编码小RNA片段,研究结果显示microRNA在生物生长发育、细胞代谢、细胞增殖和细胞凋亡方面调控相关基因表达并发挥了重要作用。自1993年发现以来,越来越多的证据表明其参与了多种癌症的发生发展过程。因此对microRNA在癌症中的具体作用机制的研究至关重要,了解其下游作用相关基因,对癌症诊断、治疗疗效及预后判断具有重要价值。而在各种肿瘤中,microRNA发挥作用存在异质性,可表现为癌基因或抑癌基因,并且有研究也表明microRNA调控机制复杂,甚至存在自身调节,因此掌握microRNA具体调控机制有利于其临床具体应用。microRNA是一种非编码小RNA片段,在血清中有一定表达水平。其主要作用通过靶向结合调节基因片段从而参与nRNA转录或蛋白质翻译过程。已有研究表明microRNA参与了一系列生理和病理过程,包括器官发育,炎症反应及肿瘤的发生发展等。有研究表明microRNA参与了肝细胞癌的发生和发展过程,具有潜在的诊断价值。迄今为止,有超过2500个人类microRNA已被记录在miRRBase数据库V20中,而随着研究的深入其数量正在迅速增加。考虑到一种microRNA可以靶向调节多种]mRNA转录或一种mRNA转录可以由许多的microRNA靶向调节的现象,可以粗略估计上述mRNA序列有约10-40%通过microRNA靶向调节。因此,有必要对microRNA的靶基因进行进一步的研究。microRNA在组织及发育相关过程中既可以是出现表达水平差异化,也可出现一过性的时间段表达差异化。通过标记microRNA可以准确地从正常组织中区分出癌组织。此外目前陆续有研究表明microRNA可作为生物标记物用于癌症的诊断和预后判断。microRNA基因通常定位于RNA的内含子部分并聚集成簇和由RNA聚合酶Ⅱ在长度为几个kbmicroRNA基因组转录生成初级microRNA (pri-microRNA)。随后初级microRNA基因在某些特异性部位发生剪切,细胞核中由Drosha RNA酶剪切生成前体microRNA (pre-microRNA),而在细胞质中则由Dicer RNA酶剪切生成成熟microRNA (mature-microRNA)。成熟microRNA然后在microRNA诱导沉默复合物(miRISC)作用下结合到Argonaute 2 (AGO2)活化。实际上靶向mRNA序列3’非编码区穿过2-8个核苷酸在成熟microRNA 5’互补序列结合,上述成熟microRNA和其靶]mRNA之间如果完全互补,往往导致mRNA脱腺苷和降解,而不完善互补则导致翻译抑制。成熟microRNA也可以通过结合到靶mRNA基因的5’端非编码区或它们的编码区域(CDS)调节基因表达。CDS-位点特异性结合更多趋向于靶基因mRNA的翻译抑制,而3’端非编码区位点则趋向于促进mRNA降解过程。目前有多项研究表明microRNA对多种癌症相关基因具有调控作用,实际上起到了癌基因或抑癌基因的作用。而且有相当数量的microRNA通过研究证实其参与了癌症发生发展过程中的上皮间质转化过程。microRNA-301是定位于SKA2内含子中的一种microRNA,其上调可导致恶性细胞增殖,侵袭力增强及微血管生成增多,而下调可抑制恶性细胞增殖、迁移能力及肿瘤生长。且microRNA-301在人多能干细胞自我更新中可通过靶向作用于SFRS2及MDB2a进一步调节免疫和蛋白质组的多样性。近期陆续有研究表明microRNA-301在前列腺癌和胰腺癌组织中存在表达上调的现象,而在胆管细胞癌中出现表达下调现象。且有研究表明microRNA-301在肝癌组织中表达水平明显高于癌旁组织。在microRNA-301家族中,有研究表明microRNA-301a通过调节MEOX2参与了肺癌中ERK/CREB通路调控。microRNA-301被发现在乳腺癌中与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、他莫昔芬抵抗及微血管密度相关,且进一步研究表明FoxF2、BBC3、PTEN及Col2A1可能是microRNA-301在乳腺癌中的调控靶点。最近还有研究表明microRNA-301a在胰腺癌中通过靶向调控NF-κB抑制因子(NKRF)参与了其活性调节过程。尽管如此,microRNA-301在肝细胞癌中的诊断价值仍需进一步研究,由此本研究主要目的为探讨microRNA-301在肝细胞癌中的诊断价值及其作用机制。[材料与方法]1.研究对象：本研究第一部分实验收集2014年1月至2015年7月52例肝细胞癌手术患者术前血清标本,38例对照血清标本(体检健康者)。肝癌患者中男性36名,平均年龄53.50岁,女性患者16名,平均年龄47.19岁,均为术后病理确诊为肝细胞癌患者,排除合并其他恶性肿瘤、全身严重感染等严重疾病,所有患者术前均未行放化疗或其他生物免疫治疗。肿瘤直径≦5cm的患者13例,肿瘤直径>5cm的患者39例,合并门静脉癌栓的患者20例,AFP>400μg/L的患者36名,AFP≤400μg/L的患者16名,HBsAg (+)患者39名,HBsAg (-)患者13名,肿瘤患者巴塞罗那分期早期(A期)7例,中期(B期)25例,晚期(C期及以上)20例。采取标本的每位患者均提前告知并取得许可,本实验得到医院伦理委员会许可。所有标本均在离体15分钟后放入灭活RNA酶的冻存管中,并于-80℃冰箱保存。本实验第二部分收集到的标本为52例肝细胞癌患者的癌组织,癌旁(肿瘤边缘2cm以内)组织及相对正常肝组织(肿瘤边缘2cm以上相对正常肝组织)。肝癌细胞株MHCC-97H、SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7均购自中国科学院上海细胞库。2.研究内容：第一部分microRNA-301在肝细胞癌中的诊断意义：以52例肝细胞癌患者为研究对象,38例为对照(体检健康者)。定量PCR的方法观察测定实验组及对照组患者血清microRNA-301表达水平,应用独立样本t检验分析实验组和对照组患者血清microRNA-301表达水平的差异,并应用ROC曲线探索其诊断截断值,对microRNA-301表达水平进行诊断有效性评估,再应用单因素分析初步分析患者microRNA-301表达水平与性别、年龄、肿瘤直径及HBsAg等临床指标之间的关系,应用相关分析对microRNA-301和肝细胞癌巴塞罗那分期进行相关分析,并对巴塞罗那分期的早、中、晚期患者血清microRNA-301相对表达水平进行分析。第二部分microRNA-301在肝细胞癌中的作用机制：52例肝细胞癌患者的癌组织,癌旁组织及相对正常肝组织为研究对象,评价及分析microRNA-301在上述组织中的表达情况；并以多种肝癌细胞系为基础,检测各肝癌细胞系中microRNA-301的表达水平,筛选出差异明显的两株细胞系为研究对象。并通过转染microRNA-301检测肿瘤细胞增殖,迁移及侵袭能力,同时检测FoxF2、BBC3、 AKT、PTEN、MMP13、E-cadherin及N-cadherin等蛋白的表达情况。3.研究方法：第一部分定量PCR的方法观察测定实验组及对照组患者microRNA-301表达水平,应用ROC曲线探索其诊断价值,并分析肝细胞癌患者microRNA-301表达水平与性别、年龄、肿瘤直径、HBsAg表达水平及巴塞罗那分期等临床指标之间的关系。第二部分定量PCR的方法观察测定52例肝细胞癌患者癌组织,癌旁组织及相对正常肝组织,评价及分析microRNA-301在上述组织中的表达情况；定量PCR的方法观察测定microRNA-301在正常肝细胞系L02和肝癌细胞系MHCC-97H、 SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7的表达情况,验证microRNA-301在细胞及组织中的差异性表达后,选取差异性表达最明显的细胞系进行实验。挑选好的肝癌细胞株分别用microRNA-301进行转染,用定量PCR验证转染效果,同时将转染后的细胞进行细胞增殖、迁移和侵袭实验,将nicroRNA-301过表达及去表达后,检测FoxF2、BBC3、AKT、PTEN、MMP13、E-cadherin及N-cadherin等蛋白的表达情况,初步确定其在肝细胞癌发生发展中的作用机制。4.统计分析：本文全部数据使用Spss20.0统计软件计算机处理分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示,非正态分布资料以中位数表示均值。方差不齐使用秩和检验,P<0.05有统计学意义；采用统计方法包括方差分析,单因素t检验。[研究结果]1.对实验组(52例肝细胞癌患者)及对照组(38例)血清microRNA-301相对表达水平测定进行均值t检验,两组之间方差齐同,可进行进一步比较,均值方程t检验结果提示P<0.001,二组之间microRNA-301相对表达水平差异具有统计学意义,结果提示肝细胞癌患者血清microRNA-301相对表达水平高于对照组,P<0.001。2.对52例实验组及38例对照组做ROC曲线进行诊断预测分析,并按约登指数进行诊断截断值预测,约登指数Youden index (J)=敏感度+特异度-1,当约登指数最大时对应的浓度值为最佳截断值。本实验中最佳截断值Cutof=0.203850,约登指数=0.865(敏感度)-0.368(1-特异度)处,即诊断肝细胞癌时microRNA-301相对表达量为大于0.203850,按该截断值诊断,敏感度为86.5%,特异度为63.2%。并且表1-3及图1-3提示ROC曲线下面积为0.77>0.5,且P<0.01,该诊断性ROC曲线结果提示诊断效力具有统计学意义。3.实验结果提示microRNA-301相对表达水平与患者年龄、性别及肿瘤大小无明显相关,P值分别为0.415、0.399及0.056；而与巴塞罗那分期、是否合并门静脉癌栓、AFP水平及HbsAg是否阳性相关,P值分别为0.004、0.035、0.023及0.001。4.巴塞罗那分期按早期、中期及晚期对microRNA-301相对表达水平进行了单因素的方差分析,早期7例,中期25例,晚期20例,表1-5提示该分组经检验发现方差不齐,故采用Tamhane检验,检验结果提示早期和中期microRNA-301相对表达水平无明显差异,P=0.545；而早、中期分别与晚期microRNA-301相对表达水平具有差异,P值分别为0.006和<0.001。5. microRNA-301表达水平与巴塞罗那分期相关分析表明二者Pearson相关系数为0.825,P<0.001。6.52例肝细胞癌患者中,癌组织进展期患者microRNA-301相对表达水平高于早期患者。7.本实验按巴塞罗那分期将患者分为早期、中期及晚期3组,对3组患者的microRNA-301相对表达量进行了单因素的方差分析,表1-5提示三组仍然方差不齐,故行Tamhane检验,检验结果提示早,中及晚期三组有明显差异(P值均小于0.001),且rnicroRNA-301相对表达量呈阶梯样变化,晚期>中期>早期。8.52例肝细胞癌患者癌组织、癌旁组织及相对正常肝组织配对比较显示各配对组均存在明显差异,P值均小于0.001,有统计学意义。提示microRNA-301相对表达水平为癌组织>癌旁组织>相对正常肝组织。9. microRNA-301在各组肝癌细胞系中的表达水平均上调。表达水平如下：SMMC-7721> Hep3B> MHCC-97H> HepG2>Huh-7> LO2。SMMC-7721及Huh-7细胞株microRNA-301的表达水平差异最为明显(Huh-7<SMMC-7721)。10. microRNA-301转染上述细胞后明显影响肝癌细胞系SMMC-7721及Huh-7的增殖(MTT实验)、迁移及侵袭过程(transwell实验)。11.microRNA-301过表达及去表达后,FoxF2、MMP13、E-cadherin及N-cadherin等蛋白的表达水平在SMMC-7721细胞系中发生改变。[研究结论]1.microRNA-301在肝细胞癌患者血清、癌组织及细胞系中表达上调,为癌基因microRNA。2.血清microRNA-301相对表达水平对肝细胞癌具有一定的诊断价值。3.肝细胞癌患者血清microRNA-301表达水平与巴塞罗那分期、门静脉癌栓、AFP及HBsAg相关。4.通过改变microRNA-301表达水平可明显影响肝癌细胞系增殖、迁移及侵袭过程。5. microRNA-301表达水平通过改变FoxF2、MMP13、E-cadherin及N-cadherin等蛋白的表达水平参与肝细胞癌的发生发展过程。