研究背景急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指脓毒症、重症肺炎、多发伤等肺内外疾病侵袭机体后出现的炎性因子大量释放,肺泡上皮细胞损伤及肺表面活性物质合成减少为主要表现的临床综合征。其临床特征包括呼吸频速和呼吸窘迫,进行性低氧血症,X线呈现弥漫性肺浸润影。虽然治疗手段在不断增加,但ARDS现在仍是PICU中威胁人类生命的重要原因之一。据统计,美国每年有19万的ARDS病人,死亡率高达39.4%；而我国的死亡率更高,达到71.4%。现阶段ARDS的发病机制尚未完全明了,但是在ARDS时肺表面活性物质合成是减少的。Schmidt等发现在ARDS患者的肺泡灌洗液中肺表面活性蛋白A(surfactant associated protein A, SP-A)、肺表面活性蛋白B(surfactant associated protein B, SP-B)、肺表面活性蛋白C(surfactant associated protein C, SP-C)、二棕榈酰卵磷脂明显减少,随着ARDS的好转,它们的量相应的增加。在严重的ARDS病人给予SP-C后,能够明显的减轻缺氧,减少死亡率。microRNA (miRNA)广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA。近年来研究发现miRNA具有广泛的基因调节功能,它能对细胞的生长、分化、凋亡及关键蛋白的分泌等各个层面进行调节。多种miRNA在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的miRNA环境中,这个环境控制着成千上万的编码基因的mRNA,使得各种蛋白的表达处在一个合适的水平,调控各种关键蛋白质的表达。现阶段人们越来越重视miRNA和肺部疾病的关系的研究,人们已经对miRNA和肺的生长发育、肺纤维化、肺部肿瘤、肺部炎症等方面进行了研究,并且证实了miRNA参与了上述的生命活动。ARDS的发病机制仍未完全明了,缺乏有效的治疗手段,miRNA在ARDS发生发展过程中的作用越来越引起人们的重视。miRNA机制的研究可能是基因、蛋白水平有关ARDS/ALI发病机制及治疗研究的重要补充。目前对ARDS发病机制方面的报道很少涉及miRNA, ARDS时在miRNA水平有什么变化?我们通过miRNA芯片检测损伤前和损伤后的A549细胞,发现大量差异表达的miRNA。我们进一步对差异表达的miRNA进行靶基因的预测,发现miRNA的靶基因和肺表面活性相关蛋白、肺的生长发育、炎症、细胞凋亡、肿瘤等方面相关。我们选择了和肺表面活性相关蛋白相关的miRNA-646(miR-646)进行下面的实验,进一步探讨miR-646在实验中的变化,预测miR-646的靶基因,进一步完善ARDS的发病机制,为ARDS的治疗提供新的靶点。目的1.检测A549细胞通过脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)处理前后SP-A、 SP-C表达量的变化。2.通过微阵列芯片技术测定LPS处理A549细胞前后miRNA的差异表达谱,确定进行下面实验的差异表达的目标miRNA和目标靶基因。3.探讨miRNA参与ARDS发生发展过程中可能的机制,为ARDS的诊治寻找新的靶点。方法1.实验分为实验组及对照组,对照组是以RPMI-1640培养液处理A549细胞24小时；实验组分别以5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml的LPS处理A549细胞24小时。通过免疫细胞化学染色、western blot法检测各组细胞中的SP-A、 SP-C的表达量。并用RT-PCR方法检测各组细胞中SP-A、SP-C的mRNA的表达量。2.利用miRNA基因芯片检测10μg/ml的LPS处理前后A549细胞,找出其中差异表达大的miRNA。利用生物信息学软件(TargetScan, miRanda,Clip-seq, miRDB)预测差异表达大的miRNA的靶基因,找到一个靶基因蛋白在ARDS发生、发展过程中起重要作用的目标靶基因,确定目标miRNA和目标靶基因。并用实时荧光定量PCR的方法检测各组细胞中目标miRNA的表达量,验证基因芯片的准确性。并做目标miRNA的表达和目标靶基因蛋白表达的相关性分析。3.体外验证目标miRNA对目标靶基因蛋白的的调控作用。实验分为五组,分别为mock组、miRNA mimics组、miRNA mimics control组、miRNA inhibitor组、miRNA inhibitor control组。mock组转染A549细胞时候加miRNA mimics,不加转染剂；余各组转染时候A549细胞液分别转染miRNA mimics、miRNA mimics control、miRNA inhibitor、miRNA inhibitor control。转染24小时后做实时荧光定量PCR验证各组细胞中目标miRNA的表达量,验证转染效果。最后用western blot法检测各组细胞中的靶基因蛋白的表达量。结果1.各组细胞中SP-A、SP-C的表达量1.1LPS处理前A549细胞形态为多角形,胞质饱满,有胞质突起,呈贴壁生长,长满时融合成片,无核固缩的现象。LPS处理细胞24h后,A549细胞形态变圆,体积缩小,胞质变空亮,且胞质内出现大小不等的颗粒。1.2免疫细胞化学染色检测各组A549细胞SP-A、SP-C的表达量SP-A在对照组的相对表达量是0.0754±0.0009,在5μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.0707±0.0019,在10μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.0424±0.0028,在15μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.0155±0.0019,实验组和对照组的差异均有统计学意义(F=534.498, P<0.05)。SP-C在对照组的相对表达量是0.0508±0.0035,在5μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.0268±0.0035,在10μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.0148±0.0025,在15μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.0226±0.0035,实验组和对照组的差异均有统计学意义(F=68.388,P<0.05)。1.3western blot检测各组A549细胞SP-A、SP-C的表达量LPS处理细胞24h后western blot检测SP-A的表达量实验组较对照组均下降,P<0.05差异有统计学意义,且随着脂多糖浓度的增加,SP-A的表达量越低,呈现药物浓度依赖性。western blot检测SP-C的表达量实验组较对照组均下降,P<0.05差异有统计学意义,10μg/ml脂多糖处理组SP-C的表达量最低。1.4实时荧光定量PCR检测各组细胞SP-A、SP-C的mRNA的表达量SP-A的mRNA在对照组的相对表达量是1.0509±0.0368,在5μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.9333±0.0146,在10μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.5630±0.0097,在15μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.2636±0.0248,实验组和对照组的差异均有统计学意义(F=676.753, P<0.01)。SP-C的mRNA在对照组的相对表达量是1.0442±0.1559,在5μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.5039±0.0175,在10μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.2306±0.0574,在15μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是0.3987±0.0084,实验组和对照组的差异均有统计学意义(F=21.635,P<0.01)。以上结果表明在实验组中各组细胞的SP-A、SP-C的表达量较对照组均下降,差异具有统计学意义(P<0.05),这和在临床上ARDS时SP-A、SP-C的表达是一致的。2.芯片结果和确定目标miRNA、靶基因2.1miRNA芯片检测结果显示：筛选出处理前后2倍以上表达差异的miRNAs:表达显著上调的有31个,其中表达差异最大的两个为miR-646、 miR-1247-3p, miR-646差异达3.4倍,miR-1247-3p差异达3.2倍：显著下调的有13个,其中表达差异最大的两个为miR-4455、miR-374b-5p, miR-4455下调至0.32倍,miR-374b-5p下调至0.36倍。并用TargetScan, miRanda, Clip-seq, miRDB对差异表达的miRNA进行靶基因预测。4个软件预测miR-646共有512个靶基因,其中四个软件共有的靶基因有176个。在共有靶基因中发现一个候选靶基因为sftpc,它编码的蛋白为SP-C。SP-C在ARDS发病过程中起重要作用。所以确定进行下面实验的目标miRNA为miR-646,确定目标靶基因蛋白为SP-C。2.2实时荧光定量PCR的方法检测各组细胞中miR-646的表达量结果显示对照组miR-646的表达量是0.9597±0.020,5μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是1.6319±0.1325,10μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是2.4762±0.1380,15μg/ml脂多糖处理组的相对表达量是1.6642±0.0938。实验组和对照组的差异均有统计学意义(P<0.01),其中10μg/ml组的相对表达量最高。这和miRNA芯片结果是一致的,验证了芯片的准确性。2.3对miR-646的表达量和SP-C的表达量的相关性分析：脂多糖处理A549细胞后,miR-646的表达量和SP-C的表达量有显著相关性(P<0.05),并且呈明显的浓度依赖的负相关(pearson相关系数r=—0.916)。3.在体外验证在mi R-646对SP-C的调控作用3.1转染48小时后在荧光显微镜下观察见到细胞胞浆中有绿色荧光。收集细胞后对各组细胞做实时荧光定量PCR显示：mock组miR-646的相对表达量是256.85±90.12, miR-646mimics组miR-646的相对表达量是194215.66±12555.57,miR-646mimics control组miR-646的相对表达量是145.99±22.40,miR-646inhibitor组miR-646的相对表达量是1.04±0.23,miR-646inhibitor control组miR-646的相对表达量是173.59±15.94。miR-646mimics组、miR-646inhibitor组和mock组的差异具有统计学意义(P<0.05),提示转染成功。3.2western blot检测转然后各组A549细胞中SP-C的表达量。与mock组相比,miR-646mimics组SP-C的表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)；与mock组相比,miR-646inhibitor组SP-C的表达量明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)；与mock组相比,miR-646mimics control组、miR-646inhibitor control组SP-C的表达量无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.A549细胞经过LPS处理后SP-A、SP-C的表达量均下降,这和临床的结果是一致的。2.miR-646可能通过抑制SP-C的翻译,在ARDS过程中发挥它的生物学功能。