多囊卵巢综合征(polyeystieovariansyndrome, PCOS)是育龄期妇女的一种常见内分泌紊乱性疾病,文献报道PCOS患病率为4～12%。此外,PCOS患者还较易发生2型糖尿病及子宫内膜癌等远期并发症。PCOS患者发生内膜癌的可能性是正常年轻妇女的4倍。40岁以下年轻子宫内膜癌患者中有19%-25%患有PCOS。可见,PCOS是关乎女性一生的内分泌和代谢紊乱性疾病。国外文献报道超过60%的PCOS患者存在高胰岛素血症和胰岛素抵抗(insulin resistence, IR)。我们的前期研究报道广州地区113例PCOS患者中56.64%有胰岛素抵抗,肥胖组与非肥胖者IR的发生率分别为73.33%和50.60%。从1980年Burghen等首次报道胰岛素抵抗参与PCOS的发病后,大量研究证实IR与PCOS关系密切。目前PCOS患者IR与子宫内膜病变的临床分析认为IR是引起PCOS子宫内膜增生的高危因素,可能是上调子宫内膜局部胰岛素受体(INSR)而发挥作用。给予因子宫内膜复杂性增生行高效孕激素治疗失败的PCOS患者胰岛素增敏剂治疗后,其子宫内膜恢复正常,提示胰岛素抵抗可能参与PCOS患者子宫内膜病变的形成。因此,胰岛素抵抗与PCOS发病及子宫内膜病变的关系成为研究热点。PCOS有明显的家族聚集性,易在一级亲属中发生。Vink等研究了1332对单卵双胎和1873对双卵双胎及单胎姐妹的资料,结果表明单卵双胎PCOS表型的相似性是双卵双胎及其他类型姐妹的2倍。提示遗传因素是PCOS病因学上的一个重要因素。PCOS的发生率和病理生理表型具有明显的种族差异性。这种差异性可能与饮食、锻炼、生活方式等环境因素相关。基于PCOS患者具有家族遗传性和异质性的特点,强烈提示PCOS是由遗传和环境因素两方面共同作用产生的。PCOS的遗传并非简单遵循孟德尔遗传方式,基于非基因序列改变所致基因表达水平改变的表观遗传学异常学说提供了一个研究PCOS发生和遗传的新思路。Hickey等分析了122例PCOS不孕患者和83例正常对照女性的雄激素受体(AR)基因CAG重复序列等位基因频度分布和XCI模式,结果显示PCOS不孕患者CAG等位基因长度大于22的发生率要显著高于对照组和普通人群,PCOS患者优先表达长CAG重复序列等位基因。可见,AR基因位点及其甲基化模式变异会影响PCOS的发生。胰岛素基因由胰岛β细胞分泌,通过胰岛素受体(INSR)发挥作用,包括刺激卵巢间质细胞产生和分泌雄激素,抑制卵泡凋亡、减少闭锁、促进卵泡形成；增强LH刺激卵泡膜。Tucci等发现来自PCOS患者INSR附近的一个标记D19S884基因与PCOS的发病有关,其位于染色体19p13.3区域内,定位在距胰岛素基因lcm的端粒处,提示该位点应作为PCOS重要候选基因。Siegel等又发现INSR基因外显子17区的His1058(C/T)单核苷酸多态性的T等位基因与瘦型PCOS患者显著相关。上述多项研究均提示INSR基因的改变对于PCOS的发病可能有重要作用。而PCOS患者INSR基因是否有DNA甲基化等表观遗传学修饰改变国内外文献未见研究报道。表观遗传是环境与遗传相互作用中最可能的中介,是环境因素导致PCOS发病的最合理机制。最为常见的一种表观遗传学修饰就是基因DNA甲基化,启动子区域CpG岛的甲基化与基因的转录抑制有关。DNA甲基转移酶是DNA甲基化的关键酶,当其介导基因甲基化时,影响基因的转录调控,抑制基因表达,导致许多细胞信号通路的阻断,包括DNA复制、细胞周期调控、细胞黏附等。目前人类的DNMT主要由DNMT1、DNMT2、DNMT3等3个家族组成。DNMT1的主要作用是维持基因组DNA的甲基化水平,用于保持子代细胞与母细胞相同的DNA特异性甲基化模式。DNMT3家族包括两个从头甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B和一个调节蛋白DNMT3L。DNMT3a、DNMT3b的主要作用是催化DNA重新甲基化,负责在生殖细胞、胚胎干细胞中以及胚胎发育时期建立DNA甲基化模式。其中DNMT3b对于调节肿瘤细胞的生长及异常基因沉默有非常重要的作用。在子宫内膜样腺癌中,DNMT1、DNMT3B比正常组织升高2-4倍。近期对多种肿瘤的研究提示DNMT活性增高是肿瘤细胞具有特征的早期分子改变,因而受到越来越多的学者关注。PCOS是子宫内膜增生甚至子宫内膜癌的高危人群,胰岛素抵抗可影响体内雌、雄激素合成代谢,并影响IGF、IGFBP的水平.造成子宫内膜异常增生。PCOS患者是由于IR引起子宫内膜局部基因异常表达.还是IR促进加速了本身就存在基因表达异常的子宫内膜增殖.目前还没有确切的两者之间的相关性研究。我们推测表观遗传学改变导致PCOS的发生及促使子宫内膜增生甚至癌变,而造成胰岛素抵抗的生活方式是这种表观遗传学改变的环境因素。因此本课题从表观遗传学方面着手,研究有胰岛素抵抗和无胰岛素抵抗的PCOS患者子宫内膜DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白的表达水平,比较有胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗PCOS患者DNMTs表达的差异。以明确PCOS患者中IR是否通过表观遗传学作用导致DNA甲基转移酶改变,从而导致子宫内膜INSR基因启动子的甲基化状态改变而影响INSR基因的表达,使IR型PCOS患者更容易出现子宫内膜增生甚至癌变。第一部分PCOS患者胰岛素抵抗与INSR基因甲基化状态之间的关系研究根据PCOS患者具有家族遗传性和异质性的特点,多囊卵巢综合征的发生可能是由遗传因素和环境因素共同作用导致的。我尝试用表观遗传学最常见的修饰改变基因DNA甲基化来解释环境因素通过介导某些基因表型改变而导致PCOS的发生。为了明确胰岛素抵抗是否造成PCOS患者基因表观表型改变,我在DNA水平研究了有IR和无IR的PCOS患者子宫内膜INSR基因启动子DNA甲基化状态,比较两组PCOS患者之间的差异。研究方法1.标本来源及分组收集符合鹿特丹诊断标准的PCOS妇女35例。根据中国糖尿病协会的胰岛素抵抗(IR)诊断标准把患者分为IR组17例和非IR组18例。2.标本收集测量人体身高、体重、腰围和臀围,计算体质重指数和腰臀比。测定基础激素水平：测血清睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素、雌二醇、催乳素、空腹胰岛素和空腹血糖。取子宫内膜组织一部分立即置-70℃超低温冰箱保存。另一部分送组织学检查。3.采用甲基化特异性PCR (MSP)方法测定PCOS患者子宫内膜胰岛素受体基因启动子DNA甲基化状态。4.结果判断只出现甲基化引物扩增产物判定该标本INSR基因启动子发生完全甲基化；只出现非甲基化引物扩增产物判定该标本INSR基因启动子未发生甲基化；甲基化引物扩增产物和非甲基化引物扩增产物均出现则判定该标本INSR基因启动子发生部分甲基化。结果1. PCOS-IR和PCOS-NIR两组患者的年龄分别是27.5±2.9岁和27.1±4.4岁,BMI分别是26.32±3.72和21.31±3.08,WHR分别是0.89±0.04和0.82±0.03,FSH分别是7.56±2.03 IU/L和7.74±1.24IU/L,LH分别是12.73±8.51 IU/L和14.25±8.78 IU/L,E2分别是49.40±17.49 pg/ml和62.54±34.44 pg/ml,T分别是0.82±0.29 ng/ml和0.81±0.36ng/ml, FBG分别是5.53±1.01 mmol/L和4.92±0.28 mmol/L, FINS分别是119.69±63.05 pmol/ml和48.71±15.52pmol/ml, HOMA-IR分别是4.43±2.40和1.61±0.61。两组PCOS患者一般情况比较：1)IR和NIR两组PCOS患者年龄、基础性激素和组织学检查无统计学差异；2) IR组的PCOS患者体质量指数显著高于NIR组(t=4.347,P=0.000)；3) IR组的PCOS患者腰臀比显著高于NIR组(t=4.522,P=0.000)；4) IR组的PCOS患者空腹血糖显著高于NIR组(t=4.633,P=0.000)；5) IR组的PCOS患者空腹胰岛素显著高于NIR组(t=2.447,P=0.020)；6) IR组的PCOS患者胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著高于NIR组(t=4.750,P=0.000)。2.子宫内膜INSR基因MSP结果有IR和无IR的PCOS患者子宫内膜INSR基因经MSP检测均未检出完全甲基化状态的特征条带,13例IR组和11例非IR组PCOS患者显示部分甲基化状态的特征条带,4例IR组和7例非IR组PCOS患者显示非甲基化状态。有IR的PCOS患者部分甲基化状态发生率是76.47%,无IR的PCOS患者部分甲基化状态发生率61.11%,比较了IR组和无IR组基因的部分甲基化状态发生率,未见统计学差异(X2=0.957,P=0.328)。小结1.有胰岛素抵抗的PCOS患者体质量指数、腰臀比、空腹胰岛素、空腹血糖和胰岛素抵抗指数高于无胰岛素PCOS患者。2.我的实验数据表明PCOS患者INSR启动子DNA部分甲基化率高,提示PCOS发病机制与表观遗传型调控相关。第二部分PCOS患者子宫内膜INSR基因mRNA的表达胰岛素是一种重要的内分泌激素,它的作用是通过与细胞表面的胰岛素受体(INSR)结合才能传递胰岛素各种生物作用。若胰岛素对子宫内膜产生作用,需要INSR这种子宫内膜呈现胰岛素作用的物质基础。我在前一部分利用甲基化特异性PCR检测技术研究PCOS患者INSR基因启动子DNA的甲基化状态,以判断基因表观遗传学修饰有无发生改变。本实验在此基础上进一步研究PCOS患者子宫内膜INSR基因的mRNA的表达,并与非PCOS患者的表达做比较,以明确有无INSR基因DNA转录后造成的基因mRNA改变。研究方法1.患者来源及分组收集符合鹿特丹诊断标准的PCOS妇女35例。根据中国糖尿病协会的胰岛素抵抗(IR)诊断标准把患者分为PCOS-IR组17例和PCOS-NIR组18例。选择10例非PCOS妇女做对照组。2.标本收集测量人体身高、体重、腰围和臀围,计算体质重指数和腰臀比。测定基础激素水平：测血清睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素、雌二醇、催乳素、空腹胰岛素和空腹血糖。取子宫内膜组织一部分立即置-70℃超低温冰箱保存。另—部分送组织学检查。3.利用设计软件,设计出扩增INSR及内参基因GAPDH片段的引物和探针。采用荧光定量RT-PCR检测PCOS患者和非PCOS对照组子宫内膜INSR基因的mRNA。结果1. PCOS-IR、PCOS-NIR和非PCOS组患者的年龄分别是27.5±2.9岁、27.1±4.4岁和27.6±2.9岁,月经期分别是72.06±34.82天、67.78±43.64天和29.10±3.45天,BMI分别是26.32±3.72、21.31±3.08和20.14±1.93,WHR分别是0.89±0.04、0.82±0.03和0.79±0.04,FSH分别是7.56±2.03 IU/L、7.74±1.24IU/L和7.44±1.63IU/L,LH分别是12.73±8.51 IU/L、14.25±8.78IU/L和4.47±1.58IU/L,E2分别是49.40±17.49 pg/ml、62.54±34.44 pg/ml和35.60±8.96pg/ml,T分别是0.82±0.29 ng/ml、0.81±0.36ng/ml和0.42±0.19ng/m1,LH/FSH分别是1.69±0.87、1.80±1.00和0.60±0.16。FB6分别是5.53±1.01 mmol/L、4.92±0.28 mmol/L和4.45±0.29mmol/L,FINS分别是119.69±63.05 pmol/ml、48.71±15.52pmol/m1和46.25±18.71pmol/ml,HOMA-IR分别是4.43±2.40、1.61±0.61和1.4±0.64。两组PCOS患者与非PCOS患者一般情况比较1)三组患者年龄、初潮年龄和月经期相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两组PCOS患者的月经周期显著长于非PCOS患者,差异有统计学意义(P<0.05)。2)三组患者的臀围和身高差异无统计学意义。非PCOS组和PCOS-NIR组之间腰围、腰臀比、体重和体质量指数相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。但两组患者的腰围、腰臀比、体重和体质量指数均显著小于PCOS-IR患者组,差异有统计学意义(P<0.05)。3)三组之间FSH、E2和PRL相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。非PCOS组患者的T、LH和LH/FSH比值均显著小于两组PCOS患者,差异有统计学意义(P<0.05)。4)非PCOS组和PCOS-NIR组的FBG、FINS和HOMA-IR均显著小于PCOS-IR组患者(P<0.05)。2. INSR的mRNA荧光定量PCR结果PCOS-IR患者子宫内膜INSRmRNA荧光定量PCR的表达值是0.11±0.16,PCOS-NIR患者子宫内膜INSRmRNA荧光定量PCR的表达值是0.16±0.19,非PCOS患者子宫内膜INSRmRNA荧光定量PCR的表达值是0.15±0.16。运用单因素方差分析,采用LSD法和Dunnett法进行均值多重比较,LSD法用T检验完成各组均值间的两两比较,结果表明每两组间(PCOS-IR组和PCOS-NIR组,PCOS-IR组和非PCOS, PCOS-NIR组和非PCOS组)的INSR荧光定量PCR表达值相比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。小结1.利用荧光实时定量PCR方法证明PCOS患者子宫内膜有INSRmRNA表达,说明PCOS患者有子宫内膜局部胰岛素抵抗的物质基础。2. IR组PCOS患者子宫内膜INSRmRNA表达有低于非IR组PCOS患者的趋势。第三部分PCOS患者子宫内膜DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的蛋白表达基因DNA甲基化是目前研究最多的表观遗传学。DNA甲基转移酶(DNMTS)是负责催化基因DNA甲基化改变的关键酶。DNMTs在机体发育和疾病发生发展中起着重要作用,DNMT活性增高是肿瘤细胞所具有特征的早期分子改变。若PCOS是一种表观遗传改变的疾病,其DNA甲基转移酶必然存在异常表达。为了探讨患者PCOS子宫内膜病变与DNA甲基转移酶的关系,在前面对INSR基因DNA甲基化研究的基础上,我利用免疫组织化学和免疫印迹方法测定PCOS患者子宫内膜DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达,并与非PCOS患者的表达做比较,以明确PCOS患者中IR是否通过表观遗传学作用导致子宫内膜DNMT1、DNMT3a和DNMT3b出现异常表达,从而使基因启动子的甲基化状态改变发生PCOS。1.标本来源及分组收集符合鹿特丹诊断标准的PCOS妇女35例。患者分为IR组17例和非IR组18例。选择10例非PCOS妇女做对照组。2.标本收集测量人体身高、体重、腰围和臀围,计算体质重指数和腰臀比。测定基础激素水平：测血清睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素、雌二醇、催乳素、空腹胰岛素和空腹血糖。取子宫内膜活检。取出的组织一部分立即置-70℃超低温冰箱保存。另一部分送组织学检查。3.采用免疫组织化学方法检测PCOS患者子宫内膜的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达,一抗为鼠抗人单克隆DNMT1、兔抗人多克隆DNMT3a和鼠抗人单克隆DNMT3b抗体。4.采用免疫印迹(Western Blot)方法测定PCOS患者子宫内膜DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达。5.免疫组织化学结果判断：细胞浆和胞核内有棕黄色颗粒沉着,且染色明显高于背景者。免疫组化半定量分析结果判定采用H-score=染色强度+阳性细胞百分率。结果1. DNMT1、DNMT3a和DNMT3b主要在子宫内膜组织的间质细胞内表达,定位于细胞浆和细胞核。2. PCOS-IR组、PCOS-NIR组和非PCOS组DNMT1的H-score评分分别是2.765±1.562,2.056±1.626和2.000±1.764。PCOS-IR组、PCOS-NIR组和非PCOS组DNMT3a的H-score评分分别是1.588±1.622,1.444±1.653和0.900±1.287。PCOS-IR组、PCOS-NIR组和非PCOS组DNMT3b的H-score评分分别是4.294±1.047,2.278±1.179和1.900±0.876。3. PCOS-IR组和PCOS-NIR组,PCOS-IR组和非PCOS, PCOS-NIR组和非PCOS组子宫内膜的DNMT1、DNMT3a免疫组织化学的H-score评分相比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。4. PCOS-IR组子宫内膜DNMT3b免疫组织化学的H-score评分高于PCOS-NIR组,差异有统计学意义(P<0.05); PCOS-IR组子宫内膜DNMT3b免疫组织化学的H-score评分显著高于非PCOS组,差异有统计学意义(P<0.05)；PCOS-NIR组和非PCOS间的子宫内膜DNMT3b免疫组织化学的H-score评分无显著性差异(P>0.05)。5. PCOS-IR组、PCOS-NIR组和非PCOS组DNMT1的免疫印迹相对表达量分别是0.172±0.127,0.165±0.195和0.097±0.074。PCOS-IR组、PCOS-NIR组和非PCOS组DNMT3a的免疫印迹相对表达量分别是0.054±0.071,0.058±0.118和0.041±0.087。PCOS-IR组、PCOS-NIR组和非PCOS组DNMT3b的免疫印迹相对表达量分别是0.766±0.603,0.408±0.395和0.291±0.218。6. PCOS-IR组和PCOS-NIR组,PCOS-IR组和非PCOS, PCOS-NIR组和非PCOS组子宫内膜的DNMT1、DNMT3a免疫印迹相对表达量相比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。7. PCOS-IR组子宫内膜DNMT3b免疫印迹相对表达量高于PCOS-NIR组,差异有统计学意义(P<0.05)；PCOS-IR组子宫内膜DNMT3b免疫印迹相对表达量显著高于非PCOS组,差异有统计学意义(P<0.05)；PCOS-NIR组和非PCOS之间的DNMT3b免疫印迹相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6.采用Spearman直线相关分析,DNMT3b免疫印迹相对表达量和DNMT1、DNMT3a的免疫印迹相对表达量,DNMT3b免疫组织化学的H-score评分、INSRmRNA表达、WHR和血睾酮存在正相关(P<0.05)。小结1.利用免疫组织化学方法检测患者的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,它们主要在子宫内膜的间质细胞内表达,定位于细胞浆和细胞核。有IR的PCOS患者子宫内膜DNMT3b的表达强于无IR的PCOS患者和非PCOS妇女。2.利用免疫印迹(Western Blot)方法发现,PCOS患者子宫内膜有DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达。有IR的PCOS患者子宫内膜DNMT3b的表达强于无IR的PCOS患者和非PCOS妇女。3.用免疫组织化学和免疫印迹方法均证明有胰岛素抵抗的PCOS患者子宫内膜DNMT3b表达高于非PCOS妇女。由于DNMT3b是介导基因DNA甲基化的关键酶,说明PCOS是一种表观遗传学疾病。4.采用Spearman直线相关分析,DNMT3b免疫印迹相对表达量与DNMT1的免疫印迹相对表达量存在正相关。5.用免疫组织化学和免疫印迹方法均证明有IR的PCOS患者子宫内膜DNMT3b的蛋白表达高于无IR的PCOS患者和非PCOS妇女。因为DNMT3b在子宫内膜癌等多种肿瘤早期表达升高,且发生早于甲基化模式异常,提示有IR的PCOS患者有发生子宫内膜癌的表观遗传学发病基础。全文小结本研究通过对有胰岛素抗体(IR)和非IR的PCOS患者子宫内膜DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达,IR对胰岛素受体(INSR)启动子DNA甲基化状态改变及相应INSRmRNA表达的相关性研究,探讨PCOS患者是否存在表观遗传学最常见修饰方式——基因DNA甲基化改变,并明确PCOS子宫内膜是否有胰岛素受体水平的抵抗因素和造成子宫内膜增生甚至癌变的表观遗传学基础。1.我的实验数据表明PCOS患者INSR启动子DNA部分甲基化率高,提示PCOS发病机制与表观遗传型调控相关。2.利用荧光实时定量PCR方法证明PCOS患者子宫内膜有INSRmRNA表达,说明它是胰岛素信号下传的物质基础。IR组PCOS患者子宫内膜INSRmRNA表达有低于非IR组PCOS患者的趋势。3.利用免疫组织化学方法检测患者的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,它们主要在子宫内膜的间质细胞内表达,定位于细胞浆和细胞核。有IR的PCOS患者子宫内膜DNMT3b的表达强于无IR的PCOS患者和非PCOS妇女。4.利用免疫印迹(Western Blot)方法发现,PCOS患者子宫内膜有DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达。有IR的PCOS患者子宫内膜DNMT3b的表达强于无IR的PCOS患者和非PCOS妇女。5.采用Spearman直线相关分析,DNMT3b免疫印迹相对表达量与DNMT1的免疫印迹相对表达量存在正相关。6.用免疫组织化学和免疫印迹方法均证明有胰岛素抵抗的PCOS患者子宫内膜DNMT3b表达高于非PCOS妇女。由于DNMT3b是介导基因DNA甲基化的关键酶,说明PCOS是一种表观遗传学疾病。7.用免疫组织化学和免疫印迹方法均证明有IR的PCOS患者子宫内膜DNMT3b的蛋白表达高于无IR的PCOS患者和非PCOS妇女。因为DNMT3b在子宫内膜癌等多种肿瘤早期表达升高,且发生早于甲基化模式异常,提示有IR的PCOS患者有发生子宫内膜癌的表观遗传学发病基础。本研究通过对有胰岛素抗体(IR)和非IR的PCOS患者子宫内膜DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达及其对胰岛素受体(INSR)启动子DNA甲基化状态改变及相应INSR表达的研究,证明有IR的PCOS患者子宫内膜DNMT3b的蛋白表达升高,说明有胰岛素抵抗的PCOS患者存在子宫内膜的表观遗传学的改变,因而成为子宫内膜癌的高危人群。DNMT3b免疫印迹相对表达量与DNMT1免疫印迹相对表达量存在正相关。造成胰岛素抵抗的生活方式可能是造成PCOS表观遗传学改变的环境因素。有关PCOS患者子宫内膜DNMTs表达的相关研究,经国内外文献检索,未见报道。