论文部分内容阅读
1962年,Stob等首先在玉米中发现和分离出玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）。ZEN是一种通过多种镰刀霉真菌的聚酮途径生物合成的非甾体雌激素真菌毒素。ZEN的高含量总是存在于作物和谷物副产品中,包括玉米,大麦和小麦,特别是在有利于真菌生长的环境条件下。ZEN具有许多的衍生物,包括α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol,α-ZOL）,β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol,β-ZOL）,α-玉米赤霉醇（α-zearalanol,a-ZAL）和 β-玉米赤霉醇（β-zearalanol,β-ZAL）。ZEN等是通过食物进入人体和动物体内的,其具有的雌激素毒性会导致许多生殖健康问题,对动物体的乳腺、卵巢等产生严重的危害。文献已报道了许多方法来解决这个问题,包括物理、化学、生物学方法。生物学方法的原理是利用微生物吸附或其产生的酶降解ZEN产生无毒产物,相对于物理及化学方法来说具有更安全,更有效、特异性强和更经济的特点。本文旨在发展新的ZEN降解酶,为解决ZEN的污染奠定基础。文献已经报道的ZEN降解酶为Zhd101及与其同源性高达98%以上的ZEN-JJM与Zhly-6,这些酶作用于内酯键的打开及脱酸反应,其中Zhd101的晶体结构已经解析。另一种对ZEN有脱毒功能的是过氧化物酶（EC 1.11.1.15）,毒性试验表明过氧化物酶在过氧化氢存在的条件具有ZEN脱毒效果,但是过氧化氢的存在可能会影响该酶在食品和饲料中的应用。本研究新克隆表达了两个新的ZEN降解酶基因,并对其进行了酶学表征和初步的分子改造。一、中性ZEN降解酶Zhd518编码基因的克隆、酶学表征与分子改造。经过NCBI序列比对后,人工合成了来源于Rhonocladiella mackenziei CBS 650.93的一个未知功能蛋白的编码基因,命名为zhd518基因,Zhd518蛋白与Zhd101蛋白具有65%的氨基酸序列同源性。构建BL21-pET28a-zhd518的菌株进行表达,纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测显示为29 kDa。理化性质的分析结果显示Zhd518的最适pH8.0,而已经报道的ZEN降解酶的最适pH为9.5。因此,本研究中的玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518是第一个被发现的中性ZEN降解酶。测定金属离子对酶的影响显示Zhd518酶活不会受到EDTA的影响,说明Zhd518是一种不依赖金属离子的酶。对Zhd518进行底物特异性测试,结果显示此酶对五种底物都具有酶活,而酶活不同。文献报道Zhd101的突变体Zhd101-V153H对于ZEN的酶活没有提高,但是对于α-ZOL的酶活提高了 2.7倍。本文在Zhd518的相对应位置也进行了点突变,对获得的突变体Zhd518-N156H测定底物特异性,结果显示对于ZEN的酶活没有提高,但是对于衍生物α-ZOL的酶活提高了 2.3倍,与Zhd101-V153H的结果相似。在此基础上,使用计算软件筛选了催化三联体为中心3?内的loop区氨基酸共五个,分别突变为丙氨酸A,得到五株突变株分别为Zhd518（D34A）,Zhd518（G35A）,Zhd518（G214A）,Zhd518（T217A）,Zhd518（N242A）。表达纯化以后测定重组酶的比酶活,结果显示:Zhd518（D34A）与Zhd518（G35A）酶活完全消失,Zhd518（G214A）失去75%的酶活,Zhd518（T217A）和Zhd518（N242A）的酶活没有降低,表明这五个位点中,34位、35位和214位是对比酶活具有重要影响的位点,217位和242位的突变对酶活没有影响,这将为进一步进行酶的分子改造提供基础。二、中性ZEN降解酶Zhd518（N156H）编码基因在毕赤酵母的表达。针对得到的良好突变体Zhd518（N156H）,人工设计和合成了适合于毕赤酵母密码子偏好性的全新zhd518（N156H）的基因序列,命名为zhd518s。然后构建重组质粒pHBM905M-zhd518s,按照载体的特点需要将毕赤酵母重组质粒pHBM905M-zhd518s进行线性化,即利用限制性内切酶SalI将大肠杆菌复制起始区和氨苄青霉素抗性基因切除后的线性片段转化毕赤酵母GS115,转化子通过菌落PCR筛选出阳性克隆。经过摇瓶发酵的上清液进行SDS-PAGE检测,结果显示目的蛋白的表达量随着发酵天数的增加而增加,说明该基因可以在毕赤酵母中有效表达。三、ZEN降解酶ZhdAY3编码基因的克隆、酶学表征和突变分析。经过NCBI序列比对后,人工合成了来源于Exophiala aquamarina CBS 119918的一个基因,命名为zhdAY3基因,ZhdAY3蛋白与Zhd101蛋白具有63%的氨基酸序列同源性。构建BL21-pET28a-zhdA Y3的菌株进行表达,纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测显示为29kDa。理化性质的分析结果显示ZhdAY3的最适温度与Zhd518相同,而最适pH为9.5。测定金属离子对ZhdAY3的影响的实验显示其也是非金属依赖性的酶。ZhdAY3的底物特异性结果显示对五个底物具有不同的酶活。本文在ZhdAY3与Zhd101的相对应位置也进行了点突变,对获得的Zhd518（N153H）突变体测定底物特异性,结果显示Zhd518-N153H对于ZEN的酶活没有提高,但是对于α-ZAL的酶活提高了 2.1倍,对于β-ZAL的酶活提高了 1.4倍,与Zhd518-N156H和Zhd101-V153H的结果并不一致。这是一个全新的特性,值得进行深入研究。总之,本文新挖掘了两个ZEN降解酶编码基因,并对其进行了异源表达,表征和初步的分子改造,为ZEN降解酶的理论和应用研究奠定了基础。