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目的：三萜皂苷为岗梅的主要药效活性成分,但结构复杂、分离困难等问题限制了这类成分的获取,因此研究其生物合成具有重要意义。本研究的目的是从岗梅(Ilex asprella(Hook.f.et Am.) Champ.ex Benth)转录组中发掘可能与岗梅三萜皂苷生物合成相关的关键酶基因——细胞色素P450单加氧酶(CYPs)基因,并对发掘出的候选基因进行功能鉴定,阐明岗梅三萜皂苷生物合成下游途径的氧化修饰机制,为探索三萜皂苷的人工生物合成奠定基础。方法：1. CYPs基因的筛选本研究利用12个已鉴定的三萜合成相关CYPs的氨基酸序列作为参考对象,对岗梅根转录组数据做BLASTp,筛选同源性大于40%的候选基因；将候选CYPs和已鉴定的CYPs的氨基酸序列进行系统发生分析,结合KEGG代谢通路进一步筛选可能的CYPs基因。2.基因克隆和质粒构建用试剂盒方法提取岗梅根总RNA,反转录制备cDNA后,通过PCR的方法获得目的基因。用Gateway克隆、传统的酶连接克隆或In-Fusion克隆的方法构建目的基因的表达质粒。3.蛋白功能验证研究将目的基因的表达载体用醋酸锂方法转染至能特异性表达拟南芥细胞色素P450还原酶(CPR)的酿酒酵母菌株S. cerevisiae WAT11中,用2%半乳糖诱导重组酵母表达,通过Western Blot验证蛋白的表达情况。取Western Blot验证过的阳性转化子WAT11/pEXP410(候选CYP表达菌株)、WAT11/pEXP3079+pESC-TRP-410(AS与候选CYP共表达菌株)及其他对照菌株进行诱导表达后,用MS方法检测它们的代谢产物。结果：1. CYPS候选基因综合BLASTp、系统发生分析及KEGG代谢通路分析,筛选出4个可能参与岗梅三萜皂苷生物合成的CYPs基因：CL410.Contigl可能编码α-/β-香树脂醇-24-羟化酶；CL3010.Contigl和CL3010.Contig2可能编码具有催化α-香树脂醇、β-香树脂醇、羽扇豆醇骨架C-28位氧化的氧化酶；CL3008.Contigl可能编码具有催化α-/β-香树脂醇C-12,13位环氧化的氧化酶,为接下来的基因功能鉴定奠定基础。2.候选基因CL410-1和CL3010-1的克隆和质粒构建选取两个筛选出的CYPs候选基因CL410.Contigl和CL3010.Contigl(分别命名为CL410-1、CL3010-1)进行克隆,成功构建了克隆质粒pGEM-T Easy 410以及酵母表达质粒pEXP410、pESC-TRP-410、pESC-TRP-3010。成功获得了CL410-1的全长编码区,共1545 bp,编码一个514 aa的蛋白,CL3010-1的全长编码区共1440 bp,编码一个476 aa的蛋白。3.CL410-1蛋白功能Wersten Blot结果显示,在半乳糖诱导下,重组酵母WAT11/pEXP410能够产生与预期大小相符的CL410-1蛋白,蛋白表达量由0时刻开始逐渐增多,在4h时左右达到顶峰后逐渐降低；WAT11/pEXP3079+pESC-TRP-410能够产生与预期大小相符的IaAS3079和CL410-1蛋白,但CL410-1的表达量偏低。MS分析结果显示,重组酵母菌WAT11/pEXP3079+pESC-TRP-410的培养液及菌体未能检测到预期产物的二级质谱特征离子碎片m/z422、m/z409。结论：本研究共筛选出4个可能参与岗梅三萜皂苷生物合成的CYPs基因CL410-1 CL3010-1、CL3010-2, CL3008-1,获得了CL410-1、CL3010-1基因的全长编码区。在体功能分析显示CL410-1可能不具有预期的α-/p-香树脂醇的C-24氧化功能,其确切功能有待进一步分析。