【摘 要】
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L-苏氨酸作为人体和动物体必不可少的氨基酸种类之一,在众多方面有着广阔的应用,促使L-苏氨酸的需求量日益剧增。因此实现高产L-苏氨酸菌株的构建是非常有必要的。本研究根据L-苏氨酸生物合成特点,在选育获得原产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌Ile903(Corynebacterium glutamicum Ile903)基础上,首先建立适用该菌株的电转化方案,然后采用代谢工程及基因工程育种策略对L-苏氨酸的
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L-苏氨酸作为人体和动物体必不可少的氨基酸种类之一,在众多方面有着广阔的应用,促使L-苏氨酸的需求量日益剧增。因此实现高产L-苏氨酸菌株的构建是非常有必要的。本研究根据L-苏氨酸生物合成特点,在选育获得原产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌Ile903（Corynebacterium glutamicum Ile903）基础上,首先建立适用该菌株的电转化方案,然后采用代谢工程及基因工程育种策略对L-苏氨酸的生物合成途径进行代谢修饰及相关基因的过表达并考察其L-苏氨酸的积累量,最后在原有发酵配方的基础上,对有机氮源进行适当优化,并通过30 L罐的分批补料发酵验证突变菌高密度发酵特性。主要研究结论概括如下:（1）根据原产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌Ile903特性,在原有电转方案下建立了适合该菌株的电转化方法:在含有1.0 g/L的吐温80、3.0 g/L的甘氨酸的BMG培养基培养细胞至OD562nm为0.7-0.8时制备感受态细胞,电场强度设置在0.8-0.9kv/mm,电转完迅速加入800μL含有0.5 mol/L山梨醇的BMGS,立刻放入46℃的水浴锅热激8 min,限制细胞修饰系统,复苏培养先于37℃,200 r/min培养1h,再于30℃,220 r/min复苏1-2 h,之后涂布于含有卡那霉素抗性的BMG平板,该条件下有利于外源DNA电击转化进入宿主细胞。（2）从代谢工程育种角度考虑,对L-苏氨酸合成途径的旁支路进行代谢修饰,阻断或削弱代谢支路的碳流量,达到“节流”的目的,以此研究L-苏氨酸产量变化,将代谢改造的菌株Ile903-MX进行摇瓶发酵,结果显示其L-苏氨酸产量较对照菌株Ile903提高2.36倍,由1.02 g/L提高至3.43 g/L。（3）在“节流”基础上,将构建好的菌株Ile903-MX进一步“开源”,过表达L-苏氨酸合成途径两个关键酶基因aspC及lysC,增加L-苏氨酸合成途径碳代谢流,考察构建好的Ile903-MX/pZ190菌株产酸水平,结果显示L-苏氨酸产量较对照菌株Ile903提高3.28倍,由0.98 g/L提至4.2 g/L。（4）在原有发酵配方基础上,对经代谢修饰改造Ile903-MX/pZ190菌株进行有机氮源优化,获得最优氮源组合,进一步采用30L罐补料分批发酵验证,结果显示,优化后的发酵配方L-苏氨酸产量达34.6 g/L,糖酸转化率31.4%,较优化前分别提高24.5%和6.12%。
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