研究背景和目的白血病是世界范围内常见的血液系统恶性肿瘤,是一种细胞分化障碍性疾病,其核心问题是白血病细胞失去进一步分化为成熟细胞的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。人红白血病细胞株K562最初源于一位慢性髓性白血病患者的胸膜渗出液,K562细胞携有Ph染色体t(9；22)(q34；q21),9号染色体abl基因与22号染色体bcr基因由于染色体异常重组形成bcr/abl融合基因,翻译产生P210蛋白,该蛋白是致病的主要原因,其具有增强酪氨酸激酶的活性。K562细胞在体外可被诱导向红系分化,表现为抑制该细胞的恶性增殖能力,以及具有相应的红系成熟标志。以β-珠蛋白是否表达来判断其是否真正的向红系细胞方向分化。研究证明,小鼠红白血病细胞(MEL)、K562细胞、人早幼粒白血病HL-60细胞等造血系统肿瘤细胞,都可以通过诱导分化剂在体外促进其向终末方向分化,并表达终末分化产物,从而使这些肿瘤细胞失去恶性增殖的能力。因此利用诱导分化物使癌细胞的增殖和基因的活动趋于正常,使基因表达亦趋于正常,为肿瘤的治疗领域提供了新策略。目前诱导分化疗法是肿瘤研究的新领域,尤其是白血病的治疗,使恶性肿瘤细胞能够在体内外分化诱导剂的作用下向正常细胞方向分化逆转。K562细胞是体外研究肿瘤细胞恶性表达调控的极好模型,因为他能够向多种血细胞系方向分化。因此分化策略主要是将K562细胞向红系方向诱导分化。其中,全反式维甲酸诱导分化治疗已成为治疗急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL)的首选手段。随着对白血病诱导分化机制的深入研究和动物实验的开展,诱导分化疗法将成为白血病临床治疗的主攻方向,但目前仍有诸多问题阻碍着其应用：1、诱导分化的具体机制尚未明确；2、诱导分化剂本身毒副作用大。因此白血病诱导分化相关基因或治疗靶点的发现将是解决这些问题的突破点。水通道蛋白(Aquaporin, AQP)是一组小分子跨膜蛋白家族,参与水的快速跨膜转运。对于水通道蛋白的认识最开始主要是基于AQP1的结构分析,AQP1是第一个被发现的AQPs蛋白,Agre因此获得了2003年的诺贝尔化学奖,之后陆续发现哺乳动物水通道家族有13个成员(AQPO-AQP12),其基因结构、基因表达调控、染色体定位、蛋白结构、组织分布和生理功能均得到了较为深入的研究。AQP1能使红细胞适应环境巾血浆的渗透压变化,通过调节水的运输使红细胞膨胀或皱缩。促红细胞生成素可使红细胞容积瞬间增高,胞膜AQP1密度也大大增高。研究发现氧气除了在红细胞膜上自由扩散,也能够在AQP1运输和扩散。因此AQP1既是红细胞胞内胞外水进出交换的通道,同样也是红细胞运输和交换气体的通道,AQP1不仅是水通道蛋白,还是氧气氧分子进出细胞的通道。大量研究显示AQP1的功能或表达异常与多种肿瘤的发生关系密切。用丁酸盐诱导HEL细胞向红系分化后,AQP1的转录表达明显增加,在人红白血病K562细胞中也出现了同样的结果。重要的是在AQP1启动子巾包含CACCC元件,该元件具有红细胞特异性,并且AQP1启动子的活性在K562和HEL细胞巾是非红系细胞的24倍。无论是9-顺式维甲酸(9-cis retinoic acid)还是全反式维甲酸(all-transretinoic acid), AQP1启动子中含有的维甲酸(retinoic acid, RA)反应元件可通过与RA结合诱导人红白血病细胞细胞表达AQP1,并且随着RA剂量增加,AQP1的表达明显增加,维甲酸诱导的AQP1蛋白主要在细胞质膜上表达。另外,还有研究发现除了RA,二甲亚砜和皮质类固醇亦可诱导小鼠MEL细胞表达AQP1。以上研究可以看出多种促红系分化的药物都可增强AQP1的表达,说明红白血病细胞的红系分化调控和AQP1的表达可能有着密切联系。目前对于AQP1基因的功能研究还多局限于与液体吸收或分泌有关的上皮细胞及可能协同水跨细胞转运的内皮细胞中。AQP1高表达在红白血病细胞向红系分化过程的作用如何及其具体机制,有待进一步研究。因此在以前的研究基础上,结合国内外文献资料,首次将AQP1作为靶基因,构建AQP1基因的真核表达重组载体,在K562细胞中稳定表达,同时采用逆转录病毒载体shRNA表达系统对K562细胞中AQP1基因表达进行长效抑制,研究AQP1的高表达和表达抑制对K562细胞向红系分化过程及生理生化各项指标的影响,深入研究AQP1基因在细胞诱导分化中的功能,以期进一步明确AQP1基因与白血病发生机制之间的关系,为临床诱导分化治疗白血病提供新的治疗靶点。目的确定AQP1与K562细胞红系分化的相关性。构建稳定表达AQP1基因的K562-AQP1细胞系以及稳定抑制AQP1基因表达的K562-shAQP1细胞系。比较三种不同细胞系K562、K562-AQP1、K562-shAQP1在肿瘤细胞诱导分化、生长增殖等方面的差异,明确AQP1基因的在红系分化中的新功能。应用生物信息学方法比较K562细胞与AQP1表达增高或降低的K562细胞中大量相关基因表达的变化,从而发现一组疾病相关基因在特定条件下的相互作用,为临床诱导分化治疗白血病提供一组新的治疗靶点。方法1.使用RA处理K562细胞,收集24h、48h及72h的细胞,同时设立未加RA的K562细胞为对照组。采用RA诱导K562细胞向红系分化之后,通过Real-time PCR法检测红系指标γ-globin的表达变化；分光光度法检测血红蛋白(hemoglobin)含量,研究RA对K562细胞红系分化的影响。为了研究APQ1基因与K562细胞红系分化的关联,使用Real-time PCR法、蛋白质印迹法检测RA诱导后K562细胞AQP1mRNA和蛋白表达水平。2.以人脑cDNA文库为模板,通过PCR扩增出AQP1基因的编码序列,构建pBABE-puro-AQP1真核表达载体；转染K562细胞,筛选建立稳定过表达AQP1基因的K562细胞株(K562-AQP1); real-time PCR法、细胞免疫荧光染色法及蛋白质印迹法检测AQP1转录和蛋白表达水平。通过MTT法检测细胞生长增殖、real-time PCR法检测红系指标γ-globin表达和分光光度法检测血红蛋白含量,研究AQP1过表达对K562细胞红系分化、增殖的影响。3.设计特异AQP1shRNA序列,构建pSUPER-retro-puro重组质粒,转染K562细胞,筛选建立稳定抑制AQP1基因表达的K562细胞株(K562-shAQP1); real-time PCR法、细胞免疫荧光染色法及蛋白质印迹法检测AQP1转录和蛋白表达水平。通过Real-time PCR和紫外分光光度计法比较K562-shAQP1细胞株与对照组细胞在RA诱导后红系指标γ-globin和hemoglobin的表达,研究AQP1在RA诱导K562细胞红系分化中的作用,能否阻断RA诱导的K562细胞红系分化。4.比较三种不同细胞系K562、K562-AQP1、K562-shAQP1在肿瘤细胞诱导分化、生长增殖等方面的差异,明确AQP1基因的在红系分化中的新功能。5.利用K562细胞和AQP1过表达的K562细胞所生成的全基因组表达谱芯片,获取共同表达差异基因,然后应用GO、Pathway等生物信息学方法比较相关基因表达的变化,从而发现一组白血病相关基因在特定条件下的相互作用,为临床诱导分化治疗白血病提供一组新的治疗靶点。6.本文统计分析采用SPSS13.0。计量资料的统计描述用均数±标准差的形式给出,两组比较采用两独立样本t检验,多组比较的情况下用one-way ANOVA,重复测量资料采用重复资料的方差分析；两两之间的比较,方差齐时用LSD法,不齐则用Dunnett’s T3检验法。检验水准设为P<0.05。结果1.RA体外诱导K562细胞红系分化Real-time PCR检测RA处理K562细胞不同时间后红系分化指标γ-globin mRNA的表达增加,48h时表达增加最显著(可达未加RA处理组的10.05倍),且差异具有统计学意义(F=20.191,P=0.008)。紫外分光光度计法进行K562细胞hemoglobin含量的测定结果显示,RA诱导后的K562细胞hemoglobin含量较对照K562细胞增加,且随RA作用时间延长含量递增,差异具有统计学意义(F=651.197,P<0.001)。2.AQP1基因表达与K562细胞红系分化的相关性Real-time PCR检测RA诱导K562细胞红系分化后AQP1基因mRNA的表达较对照组均有所增加(24h、48h、72h与对照组相比分别为8.23、12.81、12.57倍),不同水平间差异具有统计学意义(F=18.834,P=0.009); Western blot结果也显示AQP1蛋白表达量也随RA作用时间延长而递增。3.AQP1基因稳定过表达与K562细胞红系分化和增殖成功构建AQP1基因的真核表达载体之后,使用免疫组化法鉴定K562细胞中AQP1的表达。AQP1经一抗孵育后用goat anti-rabbit IgG-R荧光二抗显色为红色,DAPI进行核复染显色为蓝色,将抗原显色部分与核染色部分叠加在一起观察抗原表达的变化。结果显示K562-AQP1细胞中红色荧光较对照组K562细胞增强,表明pBaBb-puro-AQP1逆转录病毒载体感染K562细胞后,AQP1蛋白在细胞中的表达增多。Real-time PCR和Western blot检测K562-AQP1细胞中AQP1mRNA和蛋白表达情况。Real-time PCR检测结果显示K562-AQP1细胞中AQP1mRNA的表达较对照组增加,较对照细胞增高700倍以上,且差异具有统计学意义(t=24.845,P=0.002)；Western blot结果显示K562-AQP1细胞中AQP1蛋白表达量也有所增加。Real-time PCR结果显示,在稳定转染AQP1基因真核表达载体的K562-AQP1细胞中γ-globin mRNA的表达较对照K562细胞有所增加(7.369：1),且差异具有统计学意义(t=24.965,P=0.001)。紫外分光光度计法的测定结果显示,AQP1稳定过表达细胞株血红蛋白含量较对照K562细胞有所增加(增加49%),差异具有统计学意义(t=26.561,P<0.001)。MTT法检测K562-AQP1细胞的生长曲线结果显示,AQP1过表达组(K562-AQP1)较对照组(K562)细胞的生长速度降低(F=171.36,P=0.001),说明AQP1在促进K562细胞向红系分化的同时对细胞增殖有抑制作用。4.AQP1基因表达抑制与K562细胞诱导分化筛选建立稳定抑制AQP1基因表达的K562细胞株(K562-shAQP1)之后,细胞免疫荧光染色法检测AQP1在K562细胞巾的表达改变结果显示,AQP1荧光显色为红色,定位在细胞膜上,K562-shAQP1细胞膜上红色荧光较对照组K562细胞有所减少,表明pSUPERretro-puro-shAQP1逆转录病毒载体感染K562细胞后,AQP1蛋白在细胞中的表达受到抑制。用Real-time PCR法检测K562-shAQP1细胞中AQP1基因mRNA的表达结果显示, K562-shAQP1细胞中AQP1mRNA的表达较对照组有所下降,表达量约为对照组的27%,差异具有统计学意义(t=-34.138,P=0.001)；Western blot结果显示K562-shAQP1细胞中AQP1蛋白表达量也有所降低,Bandleade软件分析内对照GAPDH与目的蛋白条带灰度比,抑制效率达89.8%。通过比较K562-shAQP1细胞株与对照组细胞在RA诱导后红系指标γ-globin和hemoglobin的表达,研究AQP1在RA诱导K562细胞红系分化中的作用,能否阻断RA诱导的K562细胞红系分化。用Real-time PCR法检测γ-globin mRNA表达结果显示,RA作用于AQP1表达下调的K562-shAQP1细胞系24h、48h、72h的γ-globin mRNA表达量为2.348、2.926、2.836,与RA处理的对照K562细胞组(6.709、9.561、8.284)相比有所下降,差异具有统计学意义(F=53.062,P<0.001)。紫外分光光度计法的测定结果显示,RA处理的K562-shAQP1细胞系hemoglobin含量与RA处理的对照K562细胞比较也有有所降低,差异具有统计学意义(F=1.736,P=0.177)。当RA诱导K562细胞红系分化时,下调AQP1表达可抑制RA的诱导分化作用。5.应用全基因组表达谱芯片分析AQP1基因对K562细胞红系诱导分化的作用机制本研究重点分析K562组与K562-AQP1组之间的差异表达基因,其中363个基因表达上调,421个基因表达下调。这些差异表达基因的GO分类有317个,分析发现差异基因的生物学途径主要与氧气运输、程序性凋亡以及红系分化等相关；分子功能则与氧气运输活性相关,证实AQP1基因的过表达确实能促进红系分化并且在该进程中发生细胞凋亡；差异表达基因的细胞组成多为血红蛋白复合物,证实AQP1过表达能显著增加K562细胞血红蛋白的表达,表现出红系分化的显著特征。将K562组和K562-AQP1组共同上调和下调的基因经过整理筛选,上传至STRING分析这两组的差异基因所编码蛋白质的相互关系,结果发现有24个基因编码的蛋白质的相互作用主要集中在核心位置。将上述24个基因上传至pSTIING工具,进一步分析这些基因及其转录因子的网络拓扑结构,其中7个差异基因仍然处在重要结点位置,分别是：POLR2L、SOS1、 CDKN1A、PIN1、NCOA3、ATF3、FOS。再根据参与重要分子通路的基因、以及在重要GO term有所富集的基因使用pSTIING工具进行网络图谱的构建,有5个基因位于重要结点位置,分别是：TRIB3、CDKN1A、DDIT3、 ATF3、ALCAM。最终将这12个基因将进行下一步的文献挖掘,以探讨与白血病以及红系分化之间的联系。FACTA文本挖掘工具对10个差异表达基因进行进一步的分析比较,结果发现,其中大部分都与白血病相关,并且大多数基因存在大量的相关文献报道,为白血病红系分化分子靶标的筛选提供明确有力的支持。相关文献挖掘的结果发现FOS、ATF3在白血病中高表达,促进白血病细胞的增殖；SOS1、NCOA3这2个基因经文献查阅跟白血病没有直接关系,但是通过信号通路或者与相关基因融合而参与白血病的发生,在白血病的治疗以及预后起到负面作用；并且这4个基因在本研究巾均发生了下调。另外,与红系分化相关的血红蛋白HBD、HBE1、HBG2、HBQ1在K562-AQP1细胞中均差异表达上调,其中HBD基因的差异表达最显著,因此推测AQP1与血红蛋白表达关系密切,并且在红系分化过程巾存在着共表达作用。预计后期再加以实验验证。下一步再加上AQP1表达抑制的表达谱芯片进行共同研究,从巾再筛选出特异性和实用性更强的基因,作为白血病临床诊断的分子靶标候选基因。还要确定AQP1参与的信号通路以及如何发挥诱导血红蛋白表达的功能。结论本研究通过基因增加、基因抑制、Real-time PCR、Western Blot等分了生物学方法,采用Y-珠蛋白、血红蛋白表达,细胞增殖曲线作为红系分化检测指标,对水通道蛋白1(AQP1基因)在K562细胞红系分化巾的作用进行了研究,取得以下研究结果：1.维甲酸(RA)诱导K562细胞红系分化的过程巾,红系分化指标Y-珠蛋白、血红蛋白表达均明显增加：并且AQP1mRNA及蛋白的表达显著增加。确定了AQP1表达与K562细胞红系分化的相关性；2.通过构建pBABE-puro-AQP1真核表达载体确定了AQP1过表达可以显著促进K562细胞向红系分化,同时抑制细胞增殖。3.AQP1基因的表达抑制可部分阻断RA诱导的红系分化作用,证实AQP1基因在RA诱导K562细胞红系分化过程中发挥重要作用,提示AQP1基因可能作为治疗红白血病新的靶基因。4.以K562-AQP1和K562为对象,利用全基因组表达谱芯片获取差异表达基因进行分析。选取8个与AQP1基因相关的基因,分别是：差异表达下调基因FOS、ATF3、SOS1、NCOA3,以及差异表达上调基因HBD、 HBE1、HBG2、HBQ1。推测这些基因与红系分化相关,预计后期再加以实验验证并进行深入研究。本研究的创新之处1.研究AQP1的表达变化在红白血病细胞红系诱导分化中的作用及机制,国内外未见报道,有明显创新。2.本课题从基因增强、基因抑制正反两个方面研究AQP1的作用,采用高特异性的RNA干扰技术,方法先进,可望发现AQP1在红白血病诱导分化中的新机制。3.应用全基因组表达谱芯片和生物信息学工具筛选到若干红系分化相关基因,下一步拟针对这些基因再加以实验验证,进一步研究AQP1基因对K562细胞红系诱导分化的作用机制,从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶标。