研究背景辐射是广泛存在于宇宙和人类生存环境中的自然现象。辐射按本质可分为两大类；一类是电磁辐射,另一类是粒子辐射。电磁辐射仅有能量而无静止质量；粒子辐射既有能量又有静止质量。按与物质的作用方式,又可把辐射分为两类：电离辐射和非电离辐射。非电离辐射不能引起生物组织发生电离作用。电离辐射的直接作用是指射线直接将能量传递给生物分子,引起电离和激发,导致分子结构的改变和生物活性的丧失。电离辐射作用于机体,从照射之时起到细胞学观察到可见损伤的这段时间内,在细胞中进行着辐射损伤的原初和强化过程。这个原初作用过程包括物理、物理化学和化学三个阶段。在此过程中辐射能量的吸收和传递、分子的激发和电离、自由基的产生、化学键的断裂等都是在有高度组织的生物体内进行的。能量的吸收和传递使细胞中排列有序的生物大分子处于激发和电离状态,特殊的生物结构也使电子传递和自由基连锁反应得以进行,这样导致了初始的生物化学损伤。由于亚细胞结构的破坏引起了酶的释放,代谢的方向性和协调性的紊乱促使初始的生物化学损伤进一步发展,引起机体内一系列的生理生化变化直至发生病变。电离辐射可引起自由基的生成。自由基的生成是电离辐射诱发化学键断裂等生物化学过程和细胞组织器官系统直到整体发生病变的生物学阶段的重要原因。NO是近年来发现的一种新型的生物信息递质,具有独特的理化和生物学特性。它是生物体内一种极不稳定、很快被氧化成硝酸盐或亚硝酸盐的结构简单、具有氧化还原特性的氮氧自由基,体内含量少,浓度极低。生物体内产生的NO是一种无色、微溶于水,半衰期为3-5s,脂溶性较强,在生物体内可以自由地通过生物膜的气体物质。机体以L2精氨酸和活性氧为底物在一氧化氮合酶(NOS)的作用下产生NO。NO在机体作用具广泛性,双向性。它参与体内一系列生理和病理条件下的生物过程,调节循环、神经、免疫等一系列生理活动,如血管扩张、血管通透性、血小板粘附和聚集、神经信号传递、宿主防御反应等,同时也参与包括肿瘤在内的病理过程。其生成不足或过量,均会引起身体各系统的异常而发生疾病。目前发现NOS主要有3型,第1型为神经型NOS(nNOS),主要存在于神经组织中；第2型为诱导型NOS(iNOS),主要存在于巨噬细胞、中性粒细胞等的胞浆内；第3型为内皮型NOS (eNOS),主要存在于内皮细胞。其中nNOS和eNOS正常情况下存在于细胞内,称为结构型NOS(cNOS)。cNOS通常情况下合成NO的量少,主要参与机体正常生理功能的维持。iNOS可由炎症刺激等作用而诱生大量的NO,主要参与机体的病理生理过程。机体受到一定的应激因素作用后,体内iNOS的合成增加,进一步导致NO的含量增加。电离辐射作为一个外界刺激因子,当其作用于机体时,会导致iNOS的增加,进而诱导NO的合成。机体受照后,如何确定机体的受照剂量一直是放射医学的研究重点。造血组织是辐射敏感组织,机体受照后造血组织变化的严重程度和照射剂量关系密切,其损伤程度可以大致估计患者的受照剂量。有学者研究表明,在巨噬细胞和平滑肌细胞体外照射后,iNOS的表达增加,并导致NO的形成增加,体内实验也发现,大剂量射线照射后,腮腺等NO合成大量增加,并可能和辐射引起的口干燥症有关,受照动物肝脏NO也有变化。有人也提出血中NO浓度可能也反应机体的受照强度,但是并没有做深入研究。肝脏是体内NO合成的重要器官,因为肝实质细胞,Kupffer细胞,肝窦内皮细胞均能合成NO。iNOS在正常情况下不表达,在病理状态下iNOS被诱导,持续产生大量NO。NO对肝脏既有保护作用,也有损害作用,既参与许多生理过程,又参与许多病理过程。不同的量,在不同的状态下起不同作用。研究NO在辐射后肝脏中的表达,将有助于肝脏生理、病理过程的进一步提示,并对辐射后肝脏疾病的防治找到新的途径。基因组DNA和细胞膜是辐射的靶分子。作为辐射的重要靶分子,DNA在电离时极易发生结构的改变,它们在细胞的突变及癌变机制中有重要作用,与细胞老化和死亡也有紧密关系。电离辐射可使各种真核细胞分裂延迟,出现G1和G2期阻滞,S期蓄积和巨细胞形成。明显的G2期阻滞在辐射较小剂量(2Gy)时即可出现。G1期阻滞在辐射后是否出现视细胞内P53情况而定。一般认为只有表达野生型P53基因的细胞辐射后才有G1期阻滞的发生,P53基因有突变或缺失时则无。长时间暴露的NO造成DNA损伤时,P53会聚集于此,通过抑制iNOS启动子活性而降低其表达,以此保护细胞免受NO损害。因此,近年来,iNOS与P53关系的研究也日益引起学者们的关注。P53突变发生于G:C-T:A转换,这正是NO作用的主要靶点。NO与P53构成负反馈调节通路。辐射可以诱导DNA的损伤,导致P53聚集,并抑制iNOS启动子的活性,抑制其翻译,使其表达下调。过量的NO还可使p53蛋白变形,失去结合DNA的活性,从而丧失生物学功能。因此,P53控制NOS的转录,而NO则控制P53转录后的活性。NO及iNOS与P53的反馈调节影响细胞的增殖和凋亡。研究目的通过本研究,我们希望能找到辐射损伤后,外周血NO浓度及肝脏NO浓度的变化并且探讨其变化规律,以了解NO的变化在辐射损伤发生、发展中的作用。以期为辐射事故后确定机体受照剂量提供科学依据：并且初步探讨NO、iNOS和P53在放射性肝脏损伤过程中的变化及其意义。研究方法1.健康NIH小鼠饲养及照射健康NIH小鼠,雄性,体质量(18-25)g,在广州市辐照中心用60Coγ辐射源(剂量率0.3Gy/min)对小鼠进行致死剂量(9.0Gy)和半数致死剂量(6.5Gy)的照射。2.检测致死剂量和半数致死剂量照射后动物外周血中NO含量的变化情况。用一氧化氮检测试剂盒分别检测致死剂量和半数致死剂量照射后动物外周血中NO含量的变化情况。3.检测致死剂量照射下,小鼠血清及肝脏中NO的变化NO检测试剂盒分别检测致死剂量照射后血清和肝脏组织上清中的NO含量。4.免疫组化SABC法检测肝脏组织中iNOS和p53的表达对小鼠进行致死剂量和半数致死剂量的照射,照射后分别于3、6、9、12小时取肝脏组织,采用SABC染色法对iNOS和p53蛋白表达进行检测,在高倍镜下,随机取5个视野,每个视野计数300个细胞,算出阳性表达细胞总数。然后采用SPSS统计软件进行数据分析,对iNOS和p53进行相关性分析,并对不同变量间进行统计学分析。结果及讨论在6.5 Gy和9.0 Gy的辐射剂量下,受射小鼠外周血NO浓度变化趋势均呈先升高,并在6 h达到峰值,然后趋于正常值的趋势。这说明小鼠受到大剂量射线照射应激后,机体通过一定的应激方式,导致外周血NO浓度含量呈现一过性的升高,当经过一定时间后,外周血NO浓度又回到正常值范围内。6.5 Gy和9.0 Gy的辐射剂量照射下,尽管两者的外周血NO浓度均在受照后3 h出现具有统计学意义的升高,并在6h达到峰值,但9.0 Gyγ辐射剂量下其变化幅度较6.5 Gyγ辐射剂量明显,两者相比差异有统计学意义(P<0.01)。这些都表明,不同剂量照射下,机体的反应程度不同,致死剂量照射下,机体的反应更强烈。因此认为辐射损伤后动物外周血NO浓度变化趋势在一定的时间范围内可以反应机体的受照程度。至于其能否作为一个新型的生物剂量计,将有待于今后进一步的研究。在9.0 Gy剂量照射下,在照后一定的时间后,外周血和肝细胞的NO浓度和照前相比明显升高,并且能持续一段时间,至照后24h,两者的NO浓度恢复至照前水平。这说明,电离辐射作为一个刺激因子,也能使血管内皮细胞、巨嗜细胞、肝细胞等产生应激,从而导致外周血和肝细胞NO浓度的明显升高。小鼠在照射后,肝脏iNOS和P53的表达也随着时间增加而升高,在6小时达到最高,并继续在较高水平表达持续一段时间,与NO的表达相一致。说明iNOS、P53和NO三者之间存在着紧密的联系。虽然从阳性细胞计数可以看到,9.OGy组阳性细胞数多于6.5Gy组,但并不存在统计学差异。说明在本实验中,6.5 Gy和9.0 Gy这二个剂量之间与iNOS和P53的表达并无关系。但对于其它剂量间有无关系,还需进一步实验来揭示。iNOS和P53的表达在不同时间点上存在着统计学差异,提示iNOS、P53在NO的发生、发展存在着密切关系。在6.5Gy和9.OGy二个剂量组中,存在同样的正相关。当机体受到电离辐射时,iNOS表达升高,产生NO,NO造成细胞DNA损害时,可触发p53的蓄积,p53可通过结合人iNOS基因转录起始位点上游区来抑制iNOS启动子的活性,从而抑制基因转录,使其表达受阻,NO水平下调。NO的持续高表达,可以直接使p53蛋白变形,失去结合DNA的活性,从而丧失生物学功能。但从本实验结果来看,6小时后,NO的表达降低,iNOS和P53同时降低,这说明还存在其它的调控通路或者这三者间的相互调控机制还需进一步的研究。