缺血性脑血管病是临床常见病、多发病之一，具有高发病率、高致死率、高致残率、高复发率、恢复缓慢的特点，严重影响患者的生活质量，给患者家庭和社会带来沉重的负担，且近年来逐渐有年轻化的趋势。在脑缺血发生时,未接受溶栓治疗者脑组织中的动脉栓子自发向远端推移出现血管再通有可能引发缺血部位过度再灌注；而接受溶栓治疗的患者血管再通虽可达到部分有效再灌注，但由于缺血脑组织微血管结构完整性与功能出现损伤,血脑屏障破坏、自身调节衰竭,而可能发生瀑布式神经损伤级联反应,导致缺血再灌注损伤。研究证实脑缺血再灌注损伤是导致患者病情加重的主要原因，因此，脑缺血后如何减轻神经细胞再灌注损伤及死亡是临床面临的重要课题。近年来随着现代免疫学和分子生物学的迅速发展，对于脑缺血再灌注损伤病理生理机制研究已取得了重大进步，目前普遍认为其病理生理机制主要包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、自由基损伤等，这几种因素并不是孤立存在的，彼此之间相互作用、相互影响，构成了一个复杂的调控网络，造成一系列病理级联反应，直接或者间接导致神经细胞凋亡/死亡，导致神经功能缺失。在脑缺血后复杂的病理损伤机制中，炎症反应、氧化应激、细胞凋亡是目前神经科学研究的热点，是脑缺血再灌注损伤的主要原因，抗氧化应激、减轻炎症损伤、抗细胞凋亡成为治疗缺血性脑血管病的主要途径之一。尽管已经有多种药物经过实验研究，证明具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，但多数未能在临床得到广泛应用，使理论和实践大大脱节。出现这种现象最主要的原因是动物与人类生理机制及耐受性等方面的差异以及脑缺血后级联反应的复杂性，单一使用阻断某一病理环节的药物可能难以奏效。所以在目前的临床治疗中，理想的神经保护剂应该具备针对缺血再灌注损伤多个损伤环节发挥保护作用的特性。阿利吉仑(Aliskiren)是近年来合成的第一个口服、非肽类、直接肾素抑制剂，相对分子量为609.8。近年来，动物和临床实验发现，阿利吉仑具有广泛的生理作用，不仅能够有效降低高血压、抑制心肌纤维化和保护靶器官，还具有抑制动脉粥样硬化进展，抗炎等作用。但是阿利吉仑是否可以起到脑保护作用，其作用机制如何均有待探索。临床上缺血性脑血管疾病多为局灶性，部分患者由于溶栓治疗或栓子自发向远端推移出现血管再通出现再灌注现象，因此，制备局灶性脑梗死并且可实现再灌注的动物模型更为接近临床实际情况。本研究选用雄性C57/BL小鼠为研究对象，采用改良Longa线栓法建立脑缺血再灌注模型，在大脑中动脉阻塞所致的脑缺血再灌注模型上观察脑缺血后HMGB1，TLR4，NF-κB，ERK1/2，HO-1，PI3K，AKT，Bcl-2和Bax的表达，确定缺血后与炎症反应、氧化损伤及凋亡的关系，并选用阿利吉仑进行干预，评价干预前后梗死体积、脑含水量、神经功能缺损评分，以及阿利吉仑对HMGB1，TLR4，NF-κB，ERK1/2，PI3K，AKT，Bcl-2和Bax信号通路的作用，初步探讨其在缺血再灌注损伤后的脑保护作用机制，并应用ERK特异性拮抗剂PD98059和PI3K特异性拮抗剂LY294002进行干预，观察上述各因子的变化，以及评价神经功能缺失、脑水肿和梗死体积情况。本研究分三部分，现将各部分内容概述如下。第一部分阿利吉仑对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗炎作用及其相关机制研究目的：观察脑缺血再灌注损伤后HMGB1/TLR4/NF-κB的变化，研究阿利吉仑对脑缺血再灌注损伤所致的炎症反应的作用，探讨阿利吉仑抗炎相关作用机制。方法：选用成年雄性C57/BL小鼠为研究对象，应用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。随机将C57/BL小鼠分为4组：假手术组（Sham），溶剂对照组（Verhicle），阿利吉仑低剂量组（L-AS），阿利吉仑高剂量组（H-AS）。Sham组：假手术前连续5天以灌胃方式给予等量生理盐水，每日一次；Vehicle组：术前连续5天以灌胃方式给予等量生理盐水，每日一次；小剂量阿利吉仑干预组(L-AS)：术前连续5天以灌胃方式给予阿利吉仑10mg/Kg，每日一次；大剂量阿利吉仑干预组(H-AS)：术前连续5天以灌胃方式给予阿利吉仑25mg/Kg，每日一次。各组取材前进行神经功能评分，干湿重法测定脑组织含水量，TTC染色评价脑梗死体积，分别用免疫组化，Western-blot和RT-qPCR的方法检测缺血脑组织中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白和mRNA水平的变化。结果：1Sham组中未见小鼠神经功能缺损，神经功能缺失评分为0分；Vehicle组在24h和72h神经功能缺损评分均较严重，L-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可降低神经功能缺损，但差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低神经功能缺损，差异有统计学意义（P＜0.05）；2与Vehicle组相比，L-AS组在24h和72h可降低脑含水量，但是差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低脑含水量，差异有统计学意义（P＜0.05）；3与Vehicle组相比，L-AS组在24h和72h可减小脑梗死体积，，但是差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低脑梗死体积，差异有统计学意义（P＜0.05）。4缺血后24h和72h，HMGB1、TLR4及NF-κB的表达均有升高。两种剂量阿利吉仑干预后均可以降低脑缺血再灌注小鼠脑组织中的炎症反应。免疫组化结果显示，与Vehicle组相比，H-AS组在24h和72h均可明显降低HMGB1、TLR4及NF-κB的阳性细胞数，有统计学差异（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可降低HMGB1、TLR4及NF-κB的阳性细胞数，但是无统计学差异（P＞0.05）。5Western blot结果显示，与Vehicle组相比，H-AS在24h和72h可明显降低胞浆HMGB1、TLR4及胞核NF-κB的蛋白表达，结果有统计学差异（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可降低胞浆HMGB1、TLR4及胞核NF-κB，但无统计差异学（P＞0.05）。6与免疫组化和Western blot结果一致，H-AS在24h和72h可明显降低TLR4及NF-κB的mRNA表达，结果有统计学差异（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可降低胞浆TLR4及NF-κB在mRNA水平的表达，但无统计学差异（P＞0.05）。而HMGB1在基因表达水平无统计学差异。结论：阿利吉仑对缺血再灌注小鼠有较好的神经保护作用，可改善脑缺血损伤后的神经功能缺失，减轻脑水肿，减小脑梗死体积，同时缺血再灌注损伤后的脑组织的HMGB1、TLR4及NF-κB的表达变化与脑组织损伤程度一致，提示脑缺血再灌注后HMGB1/NF-κB通路参与了缺血后损伤；阿利吉仑可下调TLR4表达、抑制HMGB1、NF-κB的转位，从而减轻缺血后的过度炎症反应，实现缺血后的神经保护作用。第二部分阿利吉仑对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗氧化作用及其相关机制研究目的：观察脑缺血再灌注损伤后ERK/HO-1通路的表达变化以及SOD活性和MDA含量的变化，研究阿利吉仑对脑缺血再灌注损伤所致的氧化应激反应的作用，探讨阿利吉仑抗氧化作用的相关机制。方法：选用成年雄性C57/BL小鼠为研究对象，应用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。随机将C57/BL小鼠分为5组：假手术组（Sham），溶剂对照组（Verhicle），阿利吉仑低剂量组（L-AS），阿利吉仑高剂量组（H-AS），阿利吉仑+PD98059组（AS+PD98059)。Sham组：假手术前连续5天以灌胃方式给予等量生理盐水，每日一次；Vehicle组：术前连续5天以灌胃方式给予等量生理盐水，每日一次；小剂量阿利吉仑干预组(L-AS)：术前连续5天以灌胃方式给予阿利吉仑10mg/Kg，每日一次；大剂量阿利吉仑干预组(H-AS)：术前连续5天以灌胃方式给予阿利吉仑25mg/Kg，每日一次；阿利吉仑+PD98059组（AS+PD98059)：术前连续5天以灌胃方式给予阿利吉仑25mg/Kg，每日一次，术后立即腹腔注射50mg/kg PD98059。各组取材前进行神经功能评分，干湿重法测定脑组织含水量，TTC染色评价脑梗死体积，检测超氧化物歧化酶（SOD）的活性，丙二醛（MDA）含量的变化情况，分别用免疫组化，Western-blot和RT-qPCR的方法检测缺血脑组织中ERK、HO-1蛋白和mRNA水平的变化。结果：1Sham组中未见小鼠神经功能缺损，神经功能缺失评分为0分；Vehicle组在24h和72h神经功能缺损评分均较严重，L-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可降低神经功能缺损，但差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低神经功能缺损，差异有统计学意义（P＜0.05），H-AS对神经功能缺损的这种改善作用可被ERK抑制剂PD98059阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）；2与Vehicle组相比，L-AS组在24h和72h可降低脑含水量，但是差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低脑含水量，差异有统计学意义（P＜0.05），H-AS对脑水肿的降低作用可被ERK抑制剂PD98059阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）；3与Vehicle组相比，L-AS组在24h和72h可减小脑梗死体积，但是差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低脑梗死体积，差异有统计学意义（P＜0.05），H-AS对脑梗死体积这种减小作用可被ERK抑制剂PD98059阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）。4免疫组化结果显示，与Vehicle组相比，缺血后24h和72h，H-AS组在24h和72h均可明显升高p-ERK、 HO-1的阳性细胞数，差异有统计学意义（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可升高p-ERK、HO-1的阳性细胞数，但是差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS对p-ERK、HO-1阳性细胞数的升高作用可被ERK抑制剂PD98059阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）。5Western blot结果显示，与Vehicle组相比，H-AS在24h和72h可明显升高p-ERK、 HO-1的蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可升高p-ERK、HO-1的蛋白表达，但差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS对p-ERK、HO-1蛋白的升高作用可被ERK抑制剂PD98059阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）。6与免疫组化和Western blot结果一致，H-AS在24h和72h可升高ERK、HO-1的mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可升高ERK、HO-1的mRNA表达，但差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS对p-ERK、HO-1mRNA的升高作用可被ERK抑制剂PD98059阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）。7与Vehicle组相比，H-AS可明显增加SOD，减低MDA的含量，差异有统计学意义（P＜0.05）。L-AS组可增加SOD，减低MDA的含量，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：局灶性脑缺血再灌注后，阿利吉仑对局灶性脑缺血再灌注小鼠具有脑保护作用，可改善神经功能缺失，降低脑含水量，减小脑梗死体积，诱导ERK、HO-1的表达，增加SOD活性，减少MDA的含量，且上述保护作用可被ERK抑制剂PD98059阻断，因此我们推测阿利吉仑的神经保护作用可能是通过增加ERK、HO-1的表达，并增加SOD的活性，减少MDA含量从而实现其抗氧化作用。第三部分阿利吉仑对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗凋亡作用及其相关机制研究目的：观察脑缺血再灌注损伤后PI3K/Akt/Bcl-2/Bax的表达变化，研究阿利吉仑对脑缺血再灌注损伤小鼠的抗凋亡作用，探讨阿利吉仑抗凋亡作用的相关机制。方法：选用成年雄性C57/BL小鼠为研究对象，应用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。随机将C57/BL小鼠分为5组：假手术组（Sham），溶剂对照组（Verhicle），阿利吉仑低剂量组（L-AS），阿利吉仑高剂量组（H-AS），阿利吉仑+LY-294002组（AS+LY-294002)。Sham组：假手术前连续5天以灌胃方式给予等量生理盐水，每日一次；Vehicle组：术前连续5天以灌胃方式给予等量生理盐水，每日一次；小剂量阿利吉仑干预组(L-AS)：术前连续5天以灌胃方式给予阿利吉仑10mg/Kg，每日一次；大剂量阿利吉仑干预组(H-AS)：术前连续5天以灌胃方式给予阿利吉仑25mg/Kg，每日一次；阿利吉仑组+LY-294002组（Aliskiren+LY-294002)：术前连续5天以灌胃方式给予阿利吉仑25mg/Kg，每日一次，术前15分钟脑室注射30μg LY-294002。各组取材前进行神经功能评分，干湿重法测定脑组织含水量，TTC染色评价脑梗死体积，将各组小鼠分别于相应时间点进行神经功能评分后断头处死，采用免疫组化、Westernblot和RT-qPCR来观察脑缺血后PI3K、Akt、Bcl-2及Bax的mRNA和蛋白水平动态变化。结果：1Sham组中未见小鼠神经功能缺损，神经功能缺失评分为0分；Vehicle组在24h和72h神经功能缺损评分均较严重，L-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可降低神经功能缺损，但差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低神经功能缺损，差异有统计学意义（P＜0.05），H-AS对神经功能缺损的这种改善作用可被PI3K抑制剂LY-294002阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）；2与Vehicle组相比，L-AS组在24h和72h可降低脑含水量，但是差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低脑含水量，差异有统计学意义（P＜0.05），H-AS对脑水肿的降低作用可被PI3K抑制剂LY-294002阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）；3与Vehicle组相比，L-AS组在24h和72h可减小脑梗死体积，但是差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS组在24h和72h与Vehicle组相比可明显降低脑梗死体积，差异有统计学意义（P＜0.05），H-AS对脑梗死体积这种减小作用可被PI3K抑制剂LY-294002阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）。4免疫组化结果显示，与Vehicle组相比，缺血后24h和72h，H-AS组在24h和72h均可明显升高p-PI3K、p-Akt、Bcl-2，降低Bax的阳性细胞数，差异有统计学意义（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可升高p-PI3K、p-Akt、Bcl-2，降低Bax的阳性细胞数，但是差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS对p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、 Bax阳性细胞数的作用可被PI3K抑制剂LY-294002阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）。5Western blot结果显示，与Vehicle组相比，H-AS在24h和72h可明显升高p-PI3K、p-Akt、Bcl-2，降低Bax的蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可升高p-PI3K、p-Akt、Bcl-2，降低Bax的蛋白表达，但差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS对p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白的升高作用可被PI3K抑制剂LY-294002阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）。6与免疫组化和Western blot结果一致，H-AS在24h和72h可升高Bcl-2，降低Bax的mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；L-AS组在24h和72h可升高Bcl-2，降低Bax的mRNA表达，但差异无统计学意义（P＞0.05），H-AS对Bcl-2、Bax mRNA的作用可被PI3K抑制剂LY-294002阻断，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：局灶性脑缺血再灌注后，阿利吉仑对局灶性脑缺血再灌注小鼠具有脑保护作用，可改善神经功能缺失，降低脑含水量，减小脑梗死体积，诱导PI3K、Akt、Bcl-2，降低Bax，且上述保护作用可被PI3K抑制剂LY-294002阻断，因此我们推测阿利吉仑的神经保护作用可能是通过诱导PI3K、Akt、Bcl-2，降低Bax而实现其抗凋亡作用。