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质粒DNA(pDNA)是生物化学和生物医学研究最常用的载体分子。目前磁分离法纯化pDNA的一般策略是先用RNase(主要来源为牛胰)降解RNA,得到“无RNA”的细胞裂解液,再从中回收pDNA,因而成本高昂并易引入新的免疫源。基于DNA和RNA的结构差异,建立利用磁性载体选择性纯化DNA方案,可为pDNA的纯化提供新思路。本研究以固定化金属螯合亲和层析(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)原理为基础,成功合成了 Fe304@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs,建立和优化了从DNA/RNA混合溶液中选择性脱除RNA的方案,为医用pDNA纯化提供了新的思路和技术支撑。主要研究工作及结果如下:1.用Fe3+、Fe2+和氨水共沉淀合成了 Fe3O4磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs),以2,3-二疏基丁二酸(DMSA)为巯基化试剂对其进行了表面修饰,以其为磁核通过羟胺还原法合成了 Fe3O4@Au MNPs,并对相应的反应条件进行了优化。结果显示:(1)Fe304MNPs具有超顺磁性,稳定性良好,室温条件下10日不聚沉,饱和磁化强度为53 emu/g;(2)二巯基丁二酸是非常有效的表面巯基化试剂,可使氯金酸有效还原沉积,得到金壳包覆均匀的Fe304@Au MNPs。该复合粒子呈红褐色,在555 nm处有Au的特征吸收峰,平均粒径约为35 nm,饱和磁化强度为17emu/g,用磁分离架10min即可达到完全回收;(3)利用碱老化法在Fe3O4@AuMNPs表面连接硫辛酸(TA)。同时通过有机合成制备Lys-NTA-Zn2+,并以 NHS/EDC 为缩肽试剂,制得 Fe304@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs。FTIR 充分证明了二者的有效偶联。VSM和磁分离试验表明Fe304@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs具有良好的超顺磁性和磁响应性。2.利用Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+ MNPs对大肠杆菌裂解液中的RNA进行选择性分离研究。通过改变吸附和洗脱的环境因素(如缓冲液浓度、盐离子浓度、磁性载体用量、时间、pH以及竞争性吸附剂等手段)优化了选择性吸附和洗脱RNA的条件。结果显示:磷酸根对DNA和RNA的吸附均有抑制作用,对DNA的吸附抑制更明显;在一定范围内(0～2.0mol/L),NaCl浓度的升高对RNA的吸附有促进作用;pH对RNA的吸附影响较小,但当pH<3时,吸附抑制作用较明显。在0.3 mM磷酸缓冲液(含 2.0mol/LNaCl,pH5.8)中,使用 0.25mgFe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs,在15 min内,可从300 μ大肠杆菌裂解液中选择性吸附97%RNA而不吸附pDNA;使用30 mM的EDTA溶液(含0.5 mol/LNaCl),洗脱15 min后,可洗脱下99%的RNA。酶切鉴定表明,分离纯化后的pDNA仍然保持生物活性。本研究从“pDNA/RNA混合液中选择性脱除RNA杂质”,以达到净化pDNA的目的。该方法特别适合医疗用pDNA纯化后期的精制去杂和基因疫苗的精制,也为pDNA自动化提取提供了有益探索。