目的：以携带肝细胞生长因子HGF基因以及携带绿色荧光蛋白GFP的重组腺病毒载体为原料,将病毒载体进一步扩增,并对Ad-HGF进行鉴定、纯化和滴度测定及安全性检测。方法：使用Ad-HGF和Ad-GFP,在人胚肾293细胞中进行扩增,对Ad-HGF的DNA进行PCR检测；氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,噬斑分析法、快速CPE分析测定病毒感染滴度(pfu/ml),采用敏感细胞病变法检测有复制能力的腺病毒。结果：筛选扩增完成含有目的基因的Ad-HGF, PCR法证明Ad-HGF中稳定地整合有HGF的基因,RT-PCR方法检测出病毒反应阳性293细胞中的Ad-HGF特异性mRNA,结果表明这些基因可被有效地转录。在293细胞中筛选、扩增出Ad-HGF,得到的Ad-HGF滴度为1.1xlO9pfu/ml。经氯化铯密度梯度离心后的滴度达到2.0×1012pfu/ml。制备的Ad-HGF感染A549细胞未检测到有复制能力的腺病毒存在,说明此法制备的重组腺病毒Ad-HGF有良好的使用安全性。结论：携带HGF基因的重组腺病毒Ad-HGF,可在293细胞中扩增出安全、高滴度的病毒颗粒,为研究动力性肺高压血管新生基因治疗奠定了基础。目的：测定携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒载体(Ad-GFP)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的转染效率,观察携带肝细胞生长因子的重组腺病毒载体Ad-HGF转染HUVECs后HGF基因的mRNA和蛋白的表达与分泌,同时研究Ad-HGF促进HUVECs增殖、分化以及对HUVECs分泌功能的影响。方法：以不同转染倍数(MOI)的Ad-GFP体外转染HUVECs,检测转染效率,确定最佳转染倍数。Ad-HGF以MOI=50转染HUVECs后,RT-PCR检测细胞中HGF mRNA的转录水平；以免疫组化染色检测转染Ad-HGF后目的蛋白在细胞内的表达；硝酸还原酶法检测细胞培养液中N0水平；用MTT法检测转染Ad-HGF对HUVECS的促增殖作用；将转染后的HUVECs种植于细胞外基质胶Matrigel上,观察细胞分化情况。结果：MOI=50为最佳转染效率。RT-PCR、免疫组化等方法证明：Ad-HGF可成功将HGF基因转入HUVECs中,并有目的蛋白表达与分泌；硝酸还原酶法检测提示HGF基因增加HUVECs分泌NO; MTT检测显示Ad-HGF转染对HUVECs有明显的促增殖作用；Ad-HGF转染能在体外条件下诱导HUVECs分化,刺激血管发生。结论：MOI=50时,Ad-HGF转染HUVECs可获最佳量效比。Ad-HGF体外能有效转染HUVECs, HGF基因在细胞内和细胞外均能有效地表达,同时影响HUVECs的分泌功能,并有较强的促HUVECs增殖和分化的能力,诱导体外血管发生。目的：探讨通过颈内静脉与颈总动脉端侧吻合,制作兔的动力型肺动脉高压模型的可行性。方法：幼兔60只,随机分为手术分流组(n=30),正常对照组(n=15)和假手术组(n=15),分流组动物麻醉后,分离左颈总动脉和颈内静脉,将颈内静脉近心端与颈总动脉端侧吻合,手术后给予低分子肝素肌肉注射每日两次和阿司匹林口服每日三次抗凝。每组动物在手术后4周,8周各取4只处死,剩余动物12周时处死,动物处死前行超声检查分流血管通畅情况及右心室游离壁Right ventricular anterior wall (RVAW)与左心室后壁Left ventricular posterior wall (LVPW)的比值(RVAW/LVPW),右心导管法和开胸检测肺动脉压力,监测肺动脉收缩压Pumonary Artery Systolic Pressure (PASP)、肺动脉舒张压Pumonary Artery Diastolic Pressure (PADP)及肺动脉平均压1mean Pumonary Artery Pressure (mPAP)。最后切取心脏测定右心室(RV)与左心室(LV)+室间隔Septum (LV+S)重量,肺组织病理切片观察肺小动脉病理变化,并计算管壁厚度指数Thickness Index (TI)、面积指数Area Index (AI)和肌化小动脉比例。结果：1.分流组动物存活26只,存活率86.7%,经右心导管检查及原手术部位的探查发现分流尚通畅的动物有20只,通畅率76.9%(20/26)。超声检查发现18只动物的分流通畅,超声检查的准确率90%(18/20)。2.分流组术后12周有20只形成肺动脉高压。超声心动图提示右心室前壁与左心室后壁厚度比值在分流12周后的动物(45.02±8.36)高于正常对照组(26.08±2.54)、假手术组(26.99±2.63)、分流4周(25.46±2.41)及8周(30.24±2.27)的动物；肺动脉压力检测显示：分流组动物肺动脉收缩压(PASP)40.42±3.48mmHg、舒张压(PADP)31.34±2.72mmHg、平均压(mPAP)35.33±2.67mmHg,与假手术组(PASP19.32±2.45mmHg, PADP10.35±2.19mmHg、mPAP14.78±2.23mmHg)及正常对照组(PASP18.59±4.51mmHg、PADP11.32±2.41mmHg、mPAP13.62±1.96mmHg)比较明显升高(P<0.05),并高于分流4周(PASP17.94±3.27mmHg、PADP11.31±2.38mmHg、mPAP13.54±3.42mmHg)及8周动物(PASP27.63±3.90mmHg、PADP12.31±3.51mmHg、mPAP17.59±5.04mmHg)(P<0.05)。3.分流组12周后,大体病理检查显示右心室肥厚的指标RV/(LV+S)(0.49±0.02)明显高于假手术组(0.25±0.02)、正常对照组(0.27±0.01)、分流4周(0.31±0.04)及分流8周动物(0.35±0.04)。4.分流术后12周,肺组织病理检查示分流组肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄,肺小动脉管壁厚度指数和面积指数与正常对照组、假手术组、分流4周及分流8周动物相比明显增加(TI)(42.35±5.11%vs16.71±2.99%,42.35±5.11%vs18.12±2.68%,42.35±5.11%vs17.01±3.08%,42.35±5.11%vs20.09±3.57%).(AI)(73.72±6.19%vs29.05±3.79%,73.72±6.19%vs31.92±3.01,73.72±6.19%vs30.61±2.44%,73.72±6.19%vs35.24±4.01%)(P<0.05),肌化小动脉比例分流组(56.59±7.21%)明显增加与正常对照组(22.09±3.77%)、假手术组(24.26±3.13%)、分流4周(25.12±2.99%)及分流8周动物(30.54±3.71%)相比(P<0.05)。结论：1.左颈内静脉与颈总动脉端侧吻合12周可形成分流型肺高压模型,该模型稳定、可靠、操作简单。2.精细的吻合和术后充分抗凝治疗可保证分流血管持续开放,超声检测分流血管通畅率可信。目的：在兔高动力性肺动脉高压模型上经颈内静脉转染携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF),探讨HGF基因抑制兔高动力性肺动脉高压形成的可行性。方法：采用兔左颈内静脉与颈总动脉端侧吻合手术建立高动力型肺动脉高压模型(同本实验第三部分),并将模型动物随机分为假手术Sham组(仅做左颈总动脉、颈内静脉分离)、肺高压PAH组(行左颈总动脉-颈内静脉端侧吻合建立高动力型肺动脉高压模型但不转染基因)、HGF基因转染组(行左颈总动脉-颈内静脉端侧吻合建立高动力型肺动脉高压模型,分流6周后转染Ad-HGF基因)和Empty组(行左颈总动脉-颈内静脉端侧吻合建立高动力型肺动脉高压模型,分流6周后仅注射空白腺病毒载体Ad)。术后4周、8周(转染后2周),每组各处死4只动物,其余动物术后12周(转染6周)处死,处死前行超声多普勒检查,右心导管肺动脉测压及开胸测压,处死后切取肺组织行病理检查,用RT-PCR法检测外源性目的基因mRNA表达,免疫组织化学和Westen blot检测HGF和eNOS蛋白表达；ELASA检测HGF和ET-1的变化趋势。并行Ⅷ因子染色,肺小血管计数,观察基因转染后对肺血管数量的影响。结果：本实验手术过程中无动物死亡。分流组、empty组和假手术组各有1只动物术后不明原因死亡。血管超声检查发现4只动物分流血管堵塞,死亡和分流血管堵塞的动物均自实验中剔除。Ad-HGF基因转染后2周(分流术后第8周),免疫组织化学、RT-PCR及Western Blot提示基因转染后增加了肺组织HGF和eNOS的mRNA及蛋白表达和分泌,并且eNOS的mRNA及蛋白表达与HGF变化相一致。ELISA检测发现ET-1的分泌随着HGF在组织匀浆及血浆里的表达量增加而降低。基因转染后6周(分流术后12周),超声心动图显示PAH组和empty组右室前壁与左室后壁厚度比值与基因转染组比较明显增大,假手术组与基因转染组比较则无显著统计学差异；右心导管检测及开胸后的直接测量均显示基因转染组的肺动脉平均压力(14.62±3.23mmHg)明显低于PAH组(36.35±4.63mmHg)和Empty组(34.02±4.93mmHg),而四组体循环压力比较差异无显著性。基因转染组的心脏重量/体重比值和RV/(LV+S)比值低于PAH组和Empty组(2.69±0.24vs4.89±0.18,2.69±0.24vs4.48±0.32).(0.28±0.09vs0.48±0.06,0.28±0.09vs0.49±0.11)(P<0.05)。Ⅷ因子血管染色分析显示基因转染后肺小血管明显增多,单位面积内的血管数量大于PAH组及Empty组。结论：HGF基因转染保护肺血管内皮细胞,调节内皮细胞分泌缩血管和舒血管物质的动态平衡,阻止肺血管收缩及肺血管重构,遏制PAH的病理改变；通过增加HGF在肺组织表达,促进肺血管Ⅷ因子增多诱导毛细血管新生,增加肺毛细血管密度和血流灌注,减低了肺循环阻力；阻止兔肺高压模型肺动脉压力的升高,逆转了恶化的血液动力学。