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埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)属于丝状病毒科、埃博拉病毒属，是丝状、有囊膜、单股负链RNA病毒，其主要感染人类和非人类灵长目动物，可引起严重的出血热，致死率最高可达90％。2013年12月，埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)在几内亚东南部的林区再次出现，随后，波及至塞拉利昂、利比里亚、尼日利亚、塞内加尔和马里等国。截止到2016年3月27日，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)报告统计，此次EVD疫情已导致28646人感染，11323人死亡，其感染和死亡人数已经大大超过了以前EVD疫情的总和。 EBOV基因组长约19kb，共编码7个蛋白，分别是:核蛋白(Nucleoprotein，NP)、病毒基质蛋白35、40、30和24(Viral matrix proteins35、40、30and24，VP35、VP40、VP30and VP24)、RNA依赖RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，L)和糖蛋白(Glycoprotein，GP)。VP40是EBOV含量最丰富的基质蛋白，定位于病毒囊膜下，以保证病毒粒子结构的完整性，驱动病毒粒子的形成，在病毒组装和出芽过程中起决定性的作用。EBOV GP基因编码两个阅读框，分别表达分泌性糖蛋白(Secreted GP，sGP)和GP。其中，GP是EBOV唯一的囊膜蛋白，也是病毒最重要的免疫原性蛋白，可诱导机体产生中和抗体，在细胞内可被弗林蛋白酶切割为GP1和GP2，二者之间通过二硫键连接，形成三聚体，插入到细胞膜中形成病毒粒子的囊膜蛋白。GP1的功能是同细胞表面受体结合，而GP2则负责介导病毒囊膜和细胞膜的融合。在哺乳动物或昆虫细胞中共表达EBOVVP40和GP，可以形成病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)。正是因为GP在EBOV生命活动中具有如此重要的功能，所以，对其GP基因序列进行系统进化分析以及蛋白全长的表达和功能的研究，将会有助于进一步了解病毒的进化机制和致病机理，为未来EVD疫情的预防和疫苗的研制有着重要的指导作用。 本研究中，首先为揭示2014年EVD大规模爆发中EBOV的快速进化和在人群中适应性突变规律，收集了1976-2015年间历次EVD疫情中分离的756条EBOV GP基因序列，采用多种分析软件如:PhyML，Garli，PAML和BEAST等对EVD疫情中EBOV GP基因序列进行比较分析，研究该病毒的遗传多样性、进化速率、种群动态和选择压力。结果显示，在EBOV GP基因编码序列中，未发现有影响蛋白质结构和功能的非同义替换的突变。此外，2014年西非EVD疫情和早期疫情之间dN/dS比率显著差异的原因，可能是由于随机突变的分隔造成的。同时，本文分析结果表明2014年EVD疫情中的病毒没有出现快速进化和适应性突变，因此推断导致2014年西非EVD疫情大爆发的主要原因不是病毒本身的毒力或传染性增强，而应该与非病毒因素，如环境和社会因素相关。研究结果为阐明EBOV进化机制和EVD疫情防控策略的制定提供了科学依据。 其次，为了在Escherchia coli(E.coli)中进行EBOV全长GP的表达，采用一种新的蛋白表达策略，将EBOV全长GP和VP40通过烟草蚀纹病毒或弗林蛋白酶切基序连接，成功地在E.coli中诱导表达了VP40-GP和GP-VP40融合蛋白，解决了全长GP无法在E.coli中表达的问题，为未来全长GP晶体结构的解析奠定良好的基础。 最后，为了获取EBOV VLPs和研究GP切割对其自身分泌VLPs形态的影响，分别构建真核表达质粒和重组杆状病毒表达EBOV VP40和GP，试验结果显示，目的蛋白在HEK-293T和Sf9细胞内均得到成功表达。但是，GP在HEK-293T细胞内可被切割为GP1和GP2，而在Sf9细胞内却没有被切割。在哺乳动物细胞中，无论EBOV GP是否被切割，都易于被转运至细胞外，而昆虫细胞中未被切割的GP则只有很小比例的蛋白被转运至细胞外。EBOV VP40和野生型GP共表达于HEK-293T细胞，可以形成VLPs，电镜观察显示其含有囊膜。然而，当EBOV VP40和突变型GP共转染HEK-293T细胞时，蛋白质印迹结果显示此突变型GP不能被弗林蛋白酶切割，电镜观察其形成的VLPs，显示其未有囊膜，该结果表明未被切割的全长GP可能无法插入到细胞膜中形成病毒的囊膜。重组杆状病毒可在Sf9细胞中表达EBOV VP40和GP，结果却显示GP未被切割，电镜观察其表达的VLPs，也未见有囊膜。因此，该结果也进一步暗示未被切割的全长GP无法插入到细胞膜中形成病毒的囊膜，即GP的切割对病毒囊膜的形成起着至关重要的作用。研究结果为EBOV VLPs疫苗及病毒抗血清研制奠定良好的基础。 综上所述，本研究揭示了(1)2014年西非EVD疫情中EBOV GP基因的进化速率没有随着疫情的发展而改变，同时未发现病毒中有快速进化和非同义突变;因此推断非病毒因素，如人口的增加、快速的城市化发展和落后的卫生设施可能是这次西非EVD疫情如此严重的主要原因;(2)通过与EBOV VP40的融合表达，解决了全长GP无法在Ecoli中被诱导表达的难题，成功地表达VP40-GP和GP-VP40融合蛋白;(3)EBOV GP是否被切割不影响其在HEK-293T细胞内的转运，但影响其在Sf9细胞内的转运，并且GP的切割与否对EBOV VLPs囊膜的形成有着至关重要的作用。