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氧气对包括昆虫在内的生物体至关重要，通过降低密闭仓库内氧气含量能有效防治储存豆类中的四纹豆象(Callosobruchus maculatus)。然而四纹豆象尤其是四龄幼虫对低氧表现出很强的耐受性，在2%的氧气下，四纹豆象停止取食和生长发育，而当恢复到常氧时其可恢复正常的生命活动。目前关于四纹豆象响应低氧胁迫主要集中在生物学方面，对于其分子调控机制尚不明确。本研究鉴定了低氧胁迫应答基因并对其启动子进行共有的cis-regulatoryelements(CREs)分析、鉴定调控差异表达基因(DEGs)表达的转录因子；同时对低氧胁迫中转录因子对相关基因的调控表达分子机制进行了阐述。研究结果对揭示四纹豆象响应低氧胁迫的耐受机制具有重要意义，为研究基因转录调控提供新的思路。主要结果如下：
(1)CmFKH激活低氧胁迫响应基因CmPFKFB3的起始转录
本研究克隆6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase(CmPFKFB3 )的启动子序列，通过分段验证启动子活性和凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)确定调控CmPFKFB3表达的转录因子位点位于-520~-461bp(P8)区间内。CREs分析表明P8区间含有FKH、KR、HRE三个CREs，EMSA竞争性结合实验表明CREFKH在CmPFKFB3转录表达中发挥着重要的作用。
本研究成功从四纹豆象中肠中克隆出FKH的结合蛋白CmFKH(Forkhead)，CmFKH编码431个氨基酸、具有高度保守的DNA结合结构域；同时克隆出KR的结合蛋白CmKLF(Krueppel like transcription factors)的编码区，该基因编码239个氨基酸、具有高度保守的Cys2/His2锌指结构。在果蝇S2细胞中过表达CmFKH显著增强CmPFKFB3启动子的活性，低氧处理过表达CmFKH的S2细胞进一步提高CmPFKFB3启动子的的活性，而当S2细胞过表达CmKLF、CmHIF1(Hypoxia-inducible factor 1)、DNA结合域点突变的CmFKH后，均不能观察到CmPFKFB3启动子活性的改变。体外合成的CmFKH蛋白能特异性地与CREFKH结合，低氧胁迫后四纹豆象CmFHK的mRNA表达量先增加后降低，而CmPFKFB3mRNA表达量一直处于上升趋势。实验结果表明，在低氧胁迫下，CmFKH通过与CmPFKFB3启动子上的FKHCRE相互作用，激活CmPFKFB3的起始转录。
(2)AREB6、CDX2、CEBP、CHRCREs在低氧胁迫响应基因转录中的作用研究
通过转录组分析低氧胁迫24h后四纹豆象的基因表达，共发现602个差异表达基因，其中被诱导表达和抑制表达的基因分别有408个和194个。对低氧胁迫应答基因进行注释并进行GO聚类和KEGGpathway分析，结果表明主要聚类在细胞能量代谢过程相关通路中，说明低氧胁迫对四纹豆象能量代谢过程有很大的影响。筛选具有起始密码子、能聚类到GO或KEGGpathway的46个差异表达基因，并通过基因组比对获得其中37个基因的启动子序列；通过CommonTFs软件分析，在上调基因和下调基因中分别获得19个和18个共有的CREs，其中CREsDFD、HOAX3、BARX2、BTN、SLOU、SMARCA3、DRI在低氧诱导或抑制表达的基因的启动子中均存在。
通过进一步转录因子结合位点分析确定对共有的CREsAREB6、CEBP、CDX2、ABDB、CHR、SMARCA3进行γ-32P标记并和核蛋白进行孵育，实验结果表明这些γ-32P标记的CREs探针与低氧胁迫处理前后四纹豆象中肠细胞核提取物差异性结合，竞争性结合实验证明了这些探针与核蛋白结合的特异性。荧光素酶活性实验进一步表明CREsABDB、SMARCA3在低氧胁迫应答基因CmHSP60(heat shock protein 60)、CmENOPH1(enolase-phosphatase E1)启动子中不具有功能，而CREsAREB6、CDX2、CEBP、CHR分别在调控DEGsCmScylla/CmLPCAT(lysophosphatidylcholine acyltransferase )、CmL-GalDH(L-galactose dehydrogenase )、CmGPCPD(glycerophosphocholine phosphodiesterase)、CmE63-1/CmPKA(cAMP-dependent protein kinase )转录表达中具有重要作用。
(3)CmZFH在低氧胁迫响应基因CmScylla和CmLPCAT转录表达中的作用研究
本研究成功从四纹豆象中肠中克隆出AREB6结合蛋白CmZFH(zinc-finger homeodomain)的编码区序列，该基因编码961个氨基酸，其N-端、C-端的锌指簇以及中间的homeodomain高度保守。果蝇S2细胞过表达CmZFH能显著激活CmScylla、CmLPCAT的表达，而当分别从CmScylla、CmLPCAT启动子中移除AREB6后，这种表达激活效应会消失，说明CmZFH蛋白能够特异性地与CmScylla、CmLPCAT启动子上的CREAREB6结合并激活其转录表达。原核表达的CmZFH蛋白能特异性的结合AREB6，缺失N-端锌指簇的CmZFH不能和AREB6结合、也不能激活CmScylla的转录，而缺失C-端锌指簇或homeodomain的CmZFH能与CREAREB6结合也能激活CmScylla的转录表达。
低氧胁迫能够激活四纹豆象CmZFH、CmScylla、CmLPCAT的表达，并且CmZFH的表达早于CmScylla和CmLPCAT，从表达时序上说明CmZFH对CmScylla和CmLPCAT的调控作用。沉默CmZFH之后，CmScylla、CmLPCAT在低氧胁迫下上调表达的趋势减缓。
综上所述，本研究证明了四纹豆象在低氧胁迫下，转录因子CmZFH分别与CmScylla、CmLPCAT启动子上的AREB6CREs相互作用，激活CmScylla、CmLPCAT的起始转录，同时CmZFHN-端锌指簇在CmScylla的转录激活过程中起着至关重要的作用。
(1)CmFKH激活低氧胁迫响应基因CmPFKFB3的起始转录
本研究克隆6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase(CmPFKFB3 )的启动子序列，通过分段验证启动子活性和凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)确定调控CmPFKFB3表达的转录因子位点位于-520~-461bp(P8)区间内。CREs分析表明P8区间含有FKH、KR、HRE三个CREs，EMSA竞争性结合实验表明CREFKH在CmPFKFB3转录表达中发挥着重要的作用。
本研究成功从四纹豆象中肠中克隆出FKH的结合蛋白CmFKH(Forkhead)，CmFKH编码431个氨基酸、具有高度保守的DNA结合结构域；同时克隆出KR的结合蛋白CmKLF(Krueppel like transcription factors)的编码区，该基因编码239个氨基酸、具有高度保守的Cys2/His2锌指结构。在果蝇S2细胞中过表达CmFKH显著增强CmPFKFB3启动子的活性，低氧处理过表达CmFKH的S2细胞进一步提高CmPFKFB3启动子的的活性，而当S2细胞过表达CmKLF、CmHIF1(Hypoxia-inducible factor 1)、DNA结合域点突变的CmFKH后，均不能观察到CmPFKFB3启动子活性的改变。体外合成的CmFKH蛋白能特异性地与CREFKH结合，低氧胁迫后四纹豆象CmFHK的mRNA表达量先增加后降低，而CmPFKFB3mRNA表达量一直处于上升趋势。实验结果表明，在低氧胁迫下，CmFKH通过与CmPFKFB3启动子上的FKHCRE相互作用，激活CmPFKFB3的起始转录。
(2)AREB6、CDX2、CEBP、CHRCREs在低氧胁迫响应基因转录中的作用研究
通过转录组分析低氧胁迫24h后四纹豆象的基因表达，共发现602个差异表达基因，其中被诱导表达和抑制表达的基因分别有408个和194个。对低氧胁迫应答基因进行注释并进行GO聚类和KEGGpathway分析，结果表明主要聚类在细胞能量代谢过程相关通路中，说明低氧胁迫对四纹豆象能量代谢过程有很大的影响。筛选具有起始密码子、能聚类到GO或KEGGpathway的46个差异表达基因，并通过基因组比对获得其中37个基因的启动子序列；通过CommonTFs软件分析，在上调基因和下调基因中分别获得19个和18个共有的CREs，其中CREsDFD、HOAX3、BARX2、BTN、SLOU、SMARCA3、DRI在低氧诱导或抑制表达的基因的启动子中均存在。
通过进一步转录因子结合位点分析确定对共有的CREsAREB6、CEBP、CDX2、ABDB、CHR、SMARCA3进行γ-32P标记并和核蛋白进行孵育，实验结果表明这些γ-32P标记的CREs探针与低氧胁迫处理前后四纹豆象中肠细胞核提取物差异性结合，竞争性结合实验证明了这些探针与核蛋白结合的特异性。荧光素酶活性实验进一步表明CREsABDB、SMARCA3在低氧胁迫应答基因CmHSP60(heat shock protein 60)、CmENOPH1(enolase-phosphatase E1)启动子中不具有功能，而CREsAREB6、CDX2、CEBP、CHR分别在调控DEGsCmScylla/CmLPCAT(lysophosphatidylcholine acyltransferase )、CmL-GalDH(L-galactose dehydrogenase )、CmGPCPD(glycerophosphocholine phosphodiesterase)、CmE63-1/CmPKA(cAMP-dependent protein kinase )转录表达中具有重要作用。
(3)CmZFH在低氧胁迫响应基因CmScylla和CmLPCAT转录表达中的作用研究
本研究成功从四纹豆象中肠中克隆出AREB6结合蛋白CmZFH(zinc-finger homeodomain)的编码区序列，该基因编码961个氨基酸，其N-端、C-端的锌指簇以及中间的homeodomain高度保守。果蝇S2细胞过表达CmZFH能显著激活CmScylla、CmLPCAT的表达，而当分别从CmScylla、CmLPCAT启动子中移除AREB6后，这种表达激活效应会消失，说明CmZFH蛋白能够特异性地与CmScylla、CmLPCAT启动子上的CREAREB6结合并激活其转录表达。原核表达的CmZFH蛋白能特异性的结合AREB6，缺失N-端锌指簇的CmZFH不能和AREB6结合、也不能激活CmScylla的转录，而缺失C-端锌指簇或homeodomain的CmZFH能与CREAREB6结合也能激活CmScylla的转录表达。
低氧胁迫能够激活四纹豆象CmZFH、CmScylla、CmLPCAT的表达，并且CmZFH的表达早于CmScylla和CmLPCAT，从表达时序上说明CmZFH对CmScylla和CmLPCAT的调控作用。沉默CmZFH之后，CmScylla、CmLPCAT在低氧胁迫下上调表达的趋势减缓。
综上所述，本研究证明了四纹豆象在低氧胁迫下，转录因子CmZFH分别与CmScylla、CmLPCAT启动子上的AREB6CREs相互作用，激活CmScylla、CmLPCAT的起始转录，同时CmZFHN-端锌指簇在CmScylla的转录激活过程中起着至关重要的作用。