论文部分内容阅读
神经元是大脑结构和功能的基本单元。众多的神经元通过从胞体发出的突起,构成神经回路并相互联系。基因表达、蛋白活动等分子事件,在神经元及其回路上不断发生。神经元的投射和分子活动,共同构成了脑结构和功能的基础。基因表达分析结合神经元单细胞形态,有利于更好地理解神经元的类型和功能。然而,针对组织整体目前没有研究报道在一个样本上同时获取了神经元单细胞完整形态和基因表达信息。fMOST系统的发展,为全脑尺度下神经元连接图谱和分子图谱的获取奠定了成像上的基础。GFP及其pH敏感衍生物的化学层析成像,使fMOST同时具备了宽场成像的速度和共聚焦成像的分辨率。然而,双色化学层析成像既是需求又是挑战。针对小鼠全脑这种整体生物组织,在化学层析成像获取神经元形态投射时,如何同时获取基因表达信息也存在方法上的困难。围绕全脑尺度下同时获取神经元单细胞完整形态及其基因表达信息的需求,针对这两方面研究在标记方法上的具体问题,本文的主要贡献如下:(1)确定了红色荧光蛋白pHuji兼容树脂包埋和化学层析成像,并将之与EGFP或EYFP联合,实现了双色化学层析。本文根据树脂包埋和化学层析对荧光蛋白的要求,选择了可能满足这些要求的pH敏感红色荧光蛋白pHuji并将其编码基因构建到AAV病毒载体上,实现了稀疏高亮标记神经元完整形态。通过结合EGFP进行双色标记,实现了双色化学层析成像。(2)基于EGFP和pHuji的双色标记,实现了神经元形态和突触结构的同时高亮度标记,为fMOST双色化学层析同时获取神经元单细胞完整形态和突触分布奠定了基础。本文通过AAV介导pHuji标记神经元形态,完整的EGFP融合Synapsin标记突触前,完整的EGFP融合PSD95标记突触后,实现了突触的高亮度与高准确度标记。(3)基于iDISCO的组织通透方法与杂交链式反应的信号放大方法,建立了小鼠全脑荧光原位杂交的方法。以中高丰度内源或者外源基因的mRNA为靶标,设计多个寡核苷酸探针作为一级探针,荧光染料标记的发夹对作为二级探针,实现了特定mRNA的准确标记。这一整体原位杂交方法结合fMOST断层成像时核酸染料(PI或者DAPI)实时复染,在同一个样本上同时获取了mRNA分布信息和细胞构筑背景,从而发展了一种简单、快速、精确确定mRNA在全脑中表达位置的方法。(4)利用非甲醇依赖的iDISCO组织通透方法对Thy1-EGFP-M小鼠脑块进行通透,然后进行组织整体原位杂交,既获得了基因表达信息,又保留了荧光蛋白标记的神经元形态投射信息,从而证明了基于iDISCO的整体原位杂交方法与荧光蛋白标记神经元形态投射的方法具有较好的兼容性。