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本文通过设计运用兼并性引物,成功克隆到了与播娘蒿十八碳不饱和脂肪酸合成相关的6个基因的部分序列,经过测序及生物信息学分析后,确定了这些序列片段的正确性,然后通过RACE技术,获得了这6个基因的完整的开放阅读框。这6个基因分别是:两个导致播娘蒿油酸合成的基因:Dsald9和Dsacpd9:两个导致播娘蒿亚油酸合成的基因:Dsdl2ER和Dsdl2CHL;两个导致播娘蒿亚麻酸合成的基因:Dsw3ER和Dsw3CHL。同时我们也克隆出了编码播娘蒿18S rRNA的基因的部分序列,这为我们所进行的全部的分子生物学实验提供了对照。Dsacpd9的开放阅读框大小为1203 bp,编码一个400个氨基酸的酶,其推测分子量的大小为45.3kDa:Dsald9的开放阅读框大小为1134bp,编码一个377个氨基酸的酶,其推测分子量的大小为43.2kDa:Dsdl2CHL的开放阅读框大小为1344 bp,编码一个447个氨基酸的酶,其推测分子量的大小为51.1kDa:Dsd12ER的开放阅读框大小为1152 bp,编码一个383个氨基酸的酶,其推测分子量的大小为44.1kDa;Dsw3CHL的开放阅读框大小为1356 bp,编码一个451个氨基酸的酶,其推测分子量的大小为51.6kDa;Dsw3ER的开放阅读框大小为1161 bp,编码一个386个氨基酸的酶,其推测分子量的大小为44.0kDa。通过生物信息学软件分析这几个基因及其编码的酶的性质,我们发现,Dsacpd9是定位于叶绿体内,属于可溶性蛋白;Dsald9定位于叶绿体膜,有3个跨膜区域:Dsdl2CHL定位于叶绿体,有2个跨膜区域;Dsd12ER定位于内质网,有6个跨膜区域;Dsw3CHL定位于叶绿体,有3个跨膜区域;Dsw3ER定位于内质网,有3个跨膜区域。通过瞬时表达分析,我们发现Dsacpd9、Dsdl2CHL和Dsw3ER在播娘蒿各组织中都有表达,但Dsdl2CHL和Dsw3ER瞬时表达量略低于Dsacpd9。而其他3个脱饱和酶基因则存在组织特异性表达:Dsald9仅在茎、叶、花中表达:Dsd12ER仅在根、茎、花以及发育中的种子中有较强的表达;Dsw3CHL在根、茎、叶以及花中有较强表达。
在酵母的异源表达研究中,我们根据由于Dsd12CHL和Dsd12ER作用而产生的新峰确定了这两个基因为△<12>脂肪酸脱饱和酶基因;在加入了外源亚油酸的酵母中,产生了代表亚麻酸的新峰,从而也确定了Dsw3CHL和Dsw3ER的确为ω3脂肪酸脱饱和酶。另外,在野生型酵母中,由于Dsacpd9或Dsald9的存在,其C18:1/C18:0的摩尔百分比有了显著提高,分别达到了147%和163%。同时,结合生物信息学软件分析结构,可以确定Dsacpd9和Dsald9确为△<9>脂肪酸脱饱和酶基因。
因此,我们对播娘蒿十八碳脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和功能鉴定等相关研究为对其进行遗传改良和基因工程应用奠定了理论基础。同时,也为构建其它转基因植物提供了良好有用的基因资源。