论文部分内容阅读
清道夫受体（scavenger receptors,SRs）是一种重要的模式识别受体,在宿主免疫防御等生物学过程中发挥重要的作用。SR是具有一个或多个不同结构域的膜结合受体蛋白。SR超家族成员呈现多种不同的生物学功能,其中包括对病原的识别和免疫调节。本研究我们从拟穴青蟹（Scylla paramamosain）体内发现了一种新型的清道夫受体Sp SR和一个B型清道夫受体Sp SR-B2,并发现了一种受Sp SR-B2调控的非经典i型溶菌酶Splys-i。 Sp SR具有三个富含半胱氨酸结构域（scavenger receptor cysteinerich,SRCR）结构域和一个C型凝集素结构域（C-type lectin）,在C型凝集素结构域后是跨膜区。该序列特征明显不同于其它已报到清道夫受体类型,很可能是一个新型的清道夫受体。Sp SR为I型跨膜蛋白,其c DNA序列全长10053bp,包含一个8592bp的开放阅读框,编码2683个氨基酸残基。Sp SR主要分布在肝胰腺、血细胞等组织,当受到副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌刺激时,Sp SR在血细胞和肝胰腺中的表达量均出现了不同程度的上调,表明该Sp SR可能参与抗菌免疫反应。随后我们将四个结构域进行蛋白表达和纯化,获取相应的重组蛋白。微生物及其表面多糖结合实验证明:Sp SRCRD1,Sp SRCRD2,Sp SRCRD3和Sp SRCLD可以与多种微生物及多糖结合。其中Sp SRCLD结合微生物的能力明显强于其它结构域的结合活性;在微生物多糖结合实验中,四个结构域对LPS结合活性最强,并且Sp SRCLD结合LPS的活性明显强于其它结构域。微生物凝集试验结果显示,只有Sp SRCLD能够凝集多种微生物,且凝集活性时需要钙离子参与。此外Sp SRCLD还具有结合Ac-LDL的功能,表明Sp SR具备清道夫受体的基本结构和功能特征,是一种新型的清道夫受体。弧菌经Sp SRCLD孵育后感染青蟹,更易于被青蟹机体清除;通过注射ds RNA干扰Sp SR表达,能显著降低青蟹血细胞的吞噬细菌能力以及青蟹血淋巴杀灭细菌的能力,上述研究结果表明青蟹体内清除细菌的能力与血细胞吞噬细菌的能力明显相关。综上所述,Sp SR是青蟹体内一种新型清道夫受体,其识别弧菌的能力主要依靠Sp SRCLD对LPS识别与结合,Sp SRCLD通过与细菌表面LPS的结合,可促进血细胞对细菌吞噬,从而介导青蟹抗弧菌免疫反应。 Sp SR-B2具有一个CD36结构域,并且其两端分别有一个跨膜区。Sp SR-B2是III型跨膜蛋白,其c DNA序列全长2107bp,含有一个1563bp的开放阅读框,编码520个氨基酸残基。Sp SR-B2主要在鳃中表达。当副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌刺激时,Sp SR-B2在鳃中呈现不同程度的上调表达,表明其可能参与抗菌免疫反应。重组蛋白Sp SR-B2对Ac-LDL和LPS的结合活性较强,而其它多糖的结合活性相对较差。在钙离子存在的条件下,Sp SR-B2能够使多种微生物凝集。干扰Sp SR-B2表达,可显著降低鳃中多个抗菌肽的表达水平,其中包括多个Crustins基因和一种非经典的i型溶菌酶基因。综上所述,Sp SR-B2具备B型清道夫受体的典型序列特征,并且具有结合修饰LDL和多种微生物的能力,表明该分子是青蟹体内一种B型清道夫受体。该受体能调控多种抗菌肽表达,表明其可能是抗菌肽的上游组分,其通过介导抗菌肽的表达参与抗弧菌免疫。 Splys-i是受Sp SR-B2调控的一种非经典的i型溶菌酶。比对分析和3D结构分析显示,Splys-i是一种缺失胞壁酶活性的i型溶菌酶。Splys-i主要分布在肠,胃,鳃,肝胰腺和血细胞中,并且弧菌和金黄色葡萄球菌均可以诱导其表达。Splys-i重组蛋白可抑制多种细菌和真菌的生长,但抑制细菌的能力不同。Splys-i对多种微生物具有明显的结合活性,并且对LPS、金黄色葡萄球菌LTA和PGN的结合活性明显强于来自枯草芽孢杆菌的PGN和来自真菌的β-葡聚糖。此外,Splys-i在钙离子存下可以凝集多种微生物。所有这些结果表明微生物结合活性及其触发的凝集活性,可能是导致该溶菌酶的具备抗菌活性的内在原因。此外,Splys-i具有较弱的异肽酶活性,可以水解一些革兰氏阳性细菌的肽聚糖,这意味着这种异肽酶活性也可产生一定的抗微生物活性。总之,Splys-i是青蟹体内鉴定的一种具有抗微生物活性的i型溶菌酶,虽然其缺失胞壁酸酶活性,但可通过结合活性、凝集活性和异肽酶活性等机制抑制细菌生长,这表明Splys-i是青蟹抗菌免疫体系的重要组成部分。 总之,本研究鉴定了2个清道夫受体和一个i型溶菌酶,发现它们以不同的方式参与青蟹抗弧菌免疫反应。