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目的：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)体外诱导成脂分化时,形态会由最初的长梭形或多边形逐渐变圆,直至最后形成一个典型的脂肪细胞。Rho基因可以通过调节其蛋白激酶(ROCK)及其下游蛋白MYPT、MLC等来调节肌动蛋白微丝骨架的解聚,进而来影响细胞的极性、形态及成脂情况。RhoAG14V基因,因RhoA第14位甘氨酸(Gly)变为缬氨酸(Val)而得名,该基因可以持续激活表达。因此我们将RhoAG14V基因过表达后筛选出RhoAG14V稳定过表达的细胞株并进行成脂诱导分化,以探究RhoAG14V基因过表达后对细胞成脂分化的影响,及其所在RhoA/ROCK信号通路是如何发挥作用的。期望为体内外脂肪沉积的调控和肥胖相关疾病的治疗及预防提供参考。方法：一、建立RhoA基因过表达细胞株---RhoAG14V细胞株将PlatE细胞按80%接种于6 cm培养皿中,24h后将pMSCV-puro-HA-DD-RhoA-DA转染细胞,48 h后收取病毒,取0.45μm的膜过滤置于-80℃备用；状态良好的C3H10T1/2细胞按50%-60%接种,24h后加入2μL polybrene使其终浓度为10μg/mL,放置37℃培养30 min；同时将病毒液在冰上解冻融化,感染培养48h。用含10μg/mL的puromycin的筛选培养基培养,2w以后用puromycin含量减至5μg/mL的DMEM培养基培养细胞；挑选单克隆细胞扩增后构建RhoA过表达细胞系RhoAV14,并通过测序、RT-qPCR及Western blot方法进行验证。二、RhoAG14V细胞株成脂诱导检测以5×105/cm2的密度接种对照组C3H10T1/2与RhoAG14V细胞,待其生长密度达到100%,接触抑制两天后记为Od,开始进行成脂诱导分化实验。C3H10T1/2对照组用含1.0jμmol/L地塞米松,0.5 mmol/L IBMX,10 mg/L胰岛素,5.0μmol/L罗格列酮,10%(V/V)FBS的高糖DMEM成脂诱导培养基A培养,2d后用含10 mg/L胰岛素,10%(V/V)FBS的高糖DMEM成脂维持培养基B培养48 h,后换为诱导液A,每2d更换1次诱导液,直到诱导过程结束；RhoAG14V细胞在成脂诱导组的基础上加入Shieldl保护剂,其它与对照组的处理一样,分化8d实验结束。油红O染色后显微镜拍照并观察细胞成脂状况；并于490 nm波长下异丙醇萃取检测吸光度。三、检测RhoAG14V细胞株成脂分化过程中相关基因对RhoAG14V与C3H10T1/2细胞进行成脂诱导,分别在Od、1d、3d、5d、7d利用TRIzol试剂提取RNA,反转录成cDNA,以β-Actin作为内参,利用实时定量RT-qPCR检测PPAγ、C/EBPa和RhoA基因的表达。四、检测RhoAG14V细胞株成脂分化过程中相关蛋白表达对RhoAG14V与C3H10T1/2细胞进行成脂诱导,分别在0d、1d、3d、5d、7d收取蛋白,检测RhoA/ROCK信号通路中RhoA、ROCK、MYPT1、p-MYPT、 MLC、p-MLC及成脂相关基因PPARy的蛋白表达量。五、荧光观察RhoAG14V细胞株成脂分化过程细胞骨架变化将成脂诱导的细胞分别于Od、1d、3d、5d、7d采用Anti-stainTM 488 Fluorescent Phalloidin和DAPI对细胞进行染色。用PBS缓冲液将细胞爬片冲洗2遍,4%多聚甲醛固定15 min,后用1：100稀释的Anti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin对细胞肌动蛋白骨架染色,PBS清洗去除Anti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin一抗,滴加DAPI至完全覆盖细胞以复染核,PBS清洗去除残余DAPI,封片后在荧光显微镜下观察肌动蛋白微丝骨架的分布。结果：一、建立了RhoA基因过表达RhoAG14V细胞株测序结果显示稳定过表达RhoAG14V的细胞株基因与GenBank中人的序列比对,发现除了第14位的甘氨酸改变为缬氨酸,剩余序列均与人的序列一致。RT-qPCR检测显示稳定过表达RhoAG14V的细胞株(RhoAG14V)基因的表达量约为对照组C3H10T1/2细胞系的33倍(p<0.01), Western blot检测显示稳定过表达RhoAG14V的细胞株的蛋白表达量约为对照组C3H10T1/2细胞系的1.23倍(p<0.01)。二、过表达RhoAG14V基因会降低细胞成脂分化能力利用成脂诱导培养基诱导后,C3H10T1/2与RhoA14V细胞组均可以成脂。诱导分化至8d后,C3H10T1/2组细胞呈典型的脂肪细胞表型,95%以上细胞内充满了大脂滴；RhoAG14V组细胞呈现不规则形状,仅65%左右的细胞内出现脂滴。三、过表达RhoAG14V基因会影响成脂分化关键基因实时定量RT-qPCR检测结果显示,过表达RhoAG14V组的RhoA基因在诱导分化过程中呈现逐渐下降的趋势,尤其在0-3d的下降趋势较明显；且过表达RhoAG14V组在诱导过程中成脂相关基因C/EBPa和PPARy的整体表达水平均低于C3H10T1/2组,尤其是PPARy的表达。四、过表达RhoAG14V基因会影响成脂分化关键蛋白Western blot检测RhoAG14V组和C3H10T1/2细胞在诱导分化中RhoA、 ROCK、MYPT1、p-MYPT1、MLC、p-MLC及PPARy表达的变化：RhoA蛋白表达量均呈现逐渐降低的趋势,PPARy的抑制效果明显。除去第3d,RhoAG14V组在同一时期的个时间点中ROCK、p-MYPT1、P-MLC蛋白表达量均高于C3H10T1/2组。五、过表达RhoAG14V基因会影响细胞骨架荧光显微镜下观察C3H10T1/2对照组细胞呈长梭形或多角形,呈绿色荧光的细丝状肌动蛋白呈网状有序地排列着,其周边可见应力纤维形成。RhoAG14V组细胞的肌动蛋白明显呈向心性回缩,细胞周边形成丝状和层状伪足；随着诱导时间的延长,两组细胞的细胞微丝骨架均会解聚,逐渐松弛,但RhoAG14V组细胞变圆的趋势没有对照组明显。结论：过表达RhoAG14V基因可以通过上调RhoA/ROCK信号通路的下游信号蛋白MYPT及MLC的表达来降低成脂分化标志蛋白PPARy的表达水平；同时也可以从转录水平下调C3H10T1/2细胞的成脂分化相关基因C/EBPa和PPARy的表达,进而使C3H10T1/2诱导分化过程中的成脂能力下降。