论文部分内容阅读
本实验室从人参内生菌中分离得到一株甲基营养型芽孢杆菌NJ13(Bacillus methylotrophicus),研究发现其发酵液在20%饱和度硫酸铵沉淀下的粗蛋白对于人参锈腐菌(Cylindrocarpon destructans)抑制作用显著。经Sephadex G-25脱盐,分离出2个抗菌活性峰,选择2F进行后续实验。稳定性研究发现抗菌粗蛋白2F对紫外稳定,但用氯仿和蛋白酶K处理后活性完全损失。在pH 12条件下抗菌活性损失一半,100℃和121℃条件下完全损失抗菌活性。再经DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析,Superdex75 10/300 GL凝胶过滤层析,得到纯度较高的抗菌蛋白2-1-1F,浓缩并稀释后测得抗菌蛋白浓度为0.1026mg/mL,SDS-PAGE结果显示在29KDa左右有单一条带。经质谱鉴定,抗菌蛋白氨基酸序列与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)UCMB5033鞭毛蛋白FlgG(登录号:CDG29557.1)氨基酸序列覆盖度达到了76%,等电点为4.97,分子量为27KDa,与凝胶中表观分子量几乎一致,初步确定本实验分离纯化得到的抗菌蛋白为一种鞭毛蛋白。根据贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)UCMB5033鞭毛蛋白FlgG(登录号:CDG29557.1)基因序列设计了特异性引物G1,在生防菌NJ13基因组DNA中克隆到了一段大小为777bp的基因序列,与FlgG基因片段大小相同。连接PMD18-T载体,测序后发现克隆到的基因序列与鞭毛蛋白FlgG基因序列有10个碱基的差异,但是克隆基因编码的氨基酸序列与鞭毛蛋白氨基酸序列一致。则认为克隆到的基因序列即为鞭毛蛋白基因,并对克隆基因进行生物信息学分析。双酶切回收克隆基因片段并与表达载体PET-28a(+)相连,再经双酶切、PCR和测序验证无误后,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌对克隆基因进行表达。通过对诱导剂IPTG浓度,诱导温度的摸索,确定了克隆基因表达的最佳条件,菌体经超声破碎后,对重组蛋白的抗菌活性进行了验证。本研究分离纯化得到了抗菌蛋白的单一组分,再通过基因工程实现抗菌蛋白的异源表达并验证活性。为抗病相关基因的发掘及后续抗病机理的研究打下了基础。