论文部分内容阅读
目的:具核梭杆菌已被证实与大肠癌的发生发展密切相关,然而其作用及机制尚未研究透彻。肿瘤耐药对大肠癌患者的治疗是一个严峻的挑战,提高对肿瘤耐药机制的认识可能会有助于肿瘤患者的治疗。本课题主要研究具核梭杆菌通过微小RNA调控肿瘤细胞自噬,进而诱导大肠癌细胞对化疗药物的耐受,阐明了具核梭杆菌在大肠癌发展中的重要作用,并为大肠癌的防治及微生物标记物的开发提供一定的理论基础。方法:利用具核梭杆菌感染大肠癌细胞HCT116和HT29,通过蛋白免疫印迹、共聚焦显微镜及透射电镜检测自噬情况,并分别加入化疗药物顺铂、伊立替康和自噬抑制剂氯喹后通过细胞增殖、细胞凋亡、免疫印迹分析等方法检测大肠癌细胞的耐药情况。结合具核梭杆菌感染的HT29 mRNA芯片、高/低丰度具核梭杆菌的肠癌组织microRNAs芯片及microRNAs靶基因预测软件,通过实时荧光定量PCR筛选出与具核梭杆菌及自噬相关的microRNAs;荧光素酶报告基因试验检测microRNA是否参与靶基因3’UTR转录后的调控;microRNA mimics及inhibitor分别转染具核梭杆菌感染的大肠癌细胞,通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、共聚焦显微镜及透射电镜检测细胞的自噬情况,并加入化疗药物顺铂和伊立替康通过细胞凋亡实验、免疫印迹分析等方法检测肠癌细胞的耐药情况。构建裸鼠大肠癌移植瘤模型,通过蛋白免疫印迹、透射电镜、TUNEL染色验证移植瘤组织的自噬及凋亡情况。实时荧光定量PCR检测人大肠癌组织中具核梭杆菌、目的microRNAs和自噬靶基因mRNA的关系。结果:体内外研究结果显示,肠癌细胞被具核梭杆菌感染后,其自噬水平升高,并对顺铂及伊立替康产生抗药,且该抗药性依赖于细胞自噬水平的增加。感染具核梭杆菌的肠癌细胞中,miR-18a*及miR-4802表达水平显著降低,且这两种microRNA相应的靶基因ULK1及ATG7 mRNA的表达水平显著升高。过表达miR-18a*及miR-4802可抑制肠癌细胞中具核梭杆菌所诱导的自噬,抑制miR-18a*及miR-4802则反之;过表达miR-18a*及miR-4802亦可抑制具核梭杆菌所诱导的肠癌细胞对顺铂及伊立替康药物杀伤的抵抗,并且是通过其自噬靶基因而发挥作用。人大肠癌组织中显示,具核梭杆菌丰度与miR-18a*及miR-4802表达负相关而与ULK1及ATG7 mRNA表达正相关,目的microRNA表达与其自噬靶基因mRNA表达负相关。结论:具核梭杆菌通过抑制miR-18a*及miR-4802的表达而上调自噬相关基因ULK1及ATG7,促进大肠癌细胞自噬,继而诱导大肠癌细胞产生化疗药物抵抗。miR-18a*及miR-4802有可能成为改善大肠癌患者化疗效果的有效候选靶点。