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研究背景铬(Chromium)是广泛存在于自然环境中的一种银白色金属。环境中能稳定存在的主要是六价铬(Hexavalent chromium, Cr(Ⅵ))和三价铬(Trivalent chromium, Cr(Ⅲ))。其中Cr(Ⅵ)广泛应用于包括焊接、镀铬、铁铬合金、鞣革工艺等工厂的工人职业生产中,造成的职业健康损害主要包括鼻中隔穿孔及支气管癌等。国际癌症研究机构(IARC)1990年依据人群和动物经呼吸道暴露于Cr(Ⅵ)后,肺癌发病率增加的研究结果,确定Cr(Ⅵ)为人类致癌物。近年来,由于铬水体污染事件和含铬“毒胶囊”事件的曝光,铬经消化道进入人体,造成的人群健康损伤是公共卫生领域需迫切解决的问题。已有大量的实验研究证明Cr(Ⅵ)可诱导线粒体依赖性细胞凋亡,但其诱导肝损伤的相应预防措施尚未进行详尽的探讨。Cr(Ⅵ)进入细胞后,攻击线粒体呼吸链,呼吸链电子传递受阻后,大量电子漏出,经一系列反应生成ROS。ROS造成线粒体膜氧化损伤和线粒体通透性转换,凋亡诱导因子从线粒体释放到胞浆中,启动p53-caspase级联反应,最终诱导线粒体依赖性细胞凋亡。通过抑制线粒体通透性转换,或减轻氧化应激,对Cr(Ⅵ)诱导的L-02肝细胞凋亡是否具有保护作用的研究具有重要的实际意义。自噬是近年来的研究热点,通过调节自噬活性,及时清除受损的线粒体,避免线粒体损伤的级联扩大,同时降解产物还可以作为细胞的能量来源,用于受损亚细胞器的更新,因此,调节细胞自噬活性也被认为是抑制细胞凋亡的重要措施。本研究从抑制线粒体通透性转换、抗氧化损伤、上调细胞自噬活性三个方面,探讨其对Cr(Ⅵ)诱导的线粒体依赖性L-02肝细胞凋亡的保护作用,对于探索铬暴露人群的健康保护措施具有重要的预防医学意义。研究方法1.Cr(Ⅵ)诱导线粒体依赖性L-02肝细胞凋亡用噻唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度的Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞生存率的影响,选取适宜的浓度进行后续实验。线粒体特异性荧光染料JC-1染色后,通过流式细胞仪检测不同浓度的Cr(Ⅵ)对线粒体膜电位的影响；通过定磷法用可见分光光度计检测Cr(Ⅵ)对肝细胞线粒体ATP含量的影响；用Western blot免疫组化法检测Cr(Ⅵ)处理后肝细胞VDAC1和p53蛋白表达水平；比色法用酶标仪检测Cr(Ⅵ)对肝细胞caspase-3活性的影响；Annexin V-FITC/PI双染后用流式细胞仪检测Cr(Ⅵ)染毒后的肝细胞凋亡率。2.线粒体MPT抑制剂CsA对Cr(Ⅵ)诱导的线粒体依赖性肝细胞凋亡的影响首先,用透射电镜观察线粒体超微结构,Clark氧电极测定线粒体呼吸功能,鉴定提取的线粒体质量。用MTT法检测不同浓度的CsA对L-02肝细胞生存率的影响,选取适宜的浓度进行后续实验。测定CsA对线粒体膜电位和线粒体膜蛋白VDAC1表达水平的影响。用Clark氧电极记录肝细胞线粒体呼吸耗氧曲线分析线粒体呼吸功能,包括态3呼吸、态4呼吸及呼吸控制率和线粒体氧化磷酸化效能。另外检测其他线粒体依赖性凋亡相关指标的变化,如ATP含量、p53蛋白表达水平、caspase-3活性和细胞凋亡率等,方法同前。3.ROS清除剂NAC对Cr(Ⅵ)诱导的线粒体依赖性肝细胞凋亡的影响用MTT法检测不同浓度的NAC对L-02肝细胞生存率的影响,选取适宜的浓度进行后续实验。肝细胞染毒Cr(Ⅵ)和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)后,用荧光显微镜观察细胞中DCF荧光的强弱,并用荧光酶标仪检测荧光值反映ROS的含量；用荧光酶标仪检测超氧阴离子自由基的含量；用荧光酶标仪检测Ca2+特异性荧光探针Fluo3-AM荧光含量的变化反映肝细胞内Ca2+含量的变化；利用MultiClamp700B膜片钳记录系统记录肝细胞膜上Ca2+释放激活的Ca2+通道(CRAC)电流的大小。然后,测定NAC对肝细胞线粒体膜功能和呼吸功能的影响。最后测定NAC对肝细胞能量代谢和细胞凋亡相关指标的影响,方法同前。4.自噬诱导剂Rap对Cr(Ⅵ)诱导的线粒体依赖性肝细胞凋亡的作用用MTT法检测不同浓度的自噬诱导剂雷帕霉素(Rap)和白噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对L-02肝细胞生存率的影响,选取适宜的浓度进行后续实验。用透射电镜观察肝细胞内自噬体,用Western blot法检测肝细胞内LC3-Ⅱ型自噬蛋白的聚集和mTOR通路下游蛋白4EBP1的磷酸化表达水平鉴定自噬的发生。用RT-PCR技术检测自噬基因Beclin-1和Atg7mRNA的表达水平。分别用Rap和3-MA联合Cr(Ⅵ)染毒肝细胞后,检测其对肝细胞线粒体功能,如线粒体膜电位、线粒体呼吸功能、氧化磷酸化效能和ATP含量等指标的影响,以及对细胞凋亡相关指标的影响,包括p53蛋白表达水平、caspase-3活性和细胞凋亡率等,方法同前。结果1.Cr(Ⅵ)可诱导L-02肝细胞线粒体依赖性凋亡不同浓度的Cr(VI)降低L-02肝细胞生存率,并表现出明显的剂量效应关系,选择0μM,1μM,2μM,4μM Cr(VI)作为后续实验浓度。Cr(Ⅵ)可诱导肝细胞线粒体膜电位的降低,VDAC1蛋白表达和ATP合成减少。Cr(Ⅵ)还引起p53蛋白表达增加,caspase-3活性增加以及肝细胞凋亡率增加。2.线粒体MPT抑制剂CsA对Cr(Ⅵ)诱导的线粒体依赖性肝细胞凋亡的影响本实验条件下从L-02肝细胞中提取的线粒体超微结构完整,有良好的呼吸功能。0.5μM CsA可有效抑制肝细胞生存率的降低和线粒体膜电位的降低,但对VDAC1蛋白表达没有明显保护作用。0.5μMCsA可提高肝细胞线粒体的呼吸功能、氧化磷酸化效能和ATP的含量,并降低p53蛋白表达水平和capase-3的活性,抑制肝细胞凋亡3.ROS清除剂NAC对Cr(Ⅵ)诱导的线粒体依赖性肝细胞凋亡的影响5mM NAC对4μM Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞生存率的降低有明显的保护作用。用5mM NAC干预Cr(Ⅵ)染毒的肝细胞,能显著降低肝细胞线粒体超氧阴离子自由基和ROS的含量,有效减轻氧化损伤。另外,5mM NAC能有效减轻肝细胞钙超载及肝细胞膜上Ca2+释放激活的Ca2+通道(CRAC)活性的损伤,进而抑制Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞线粒体膜电位的降低。5mM NAC对线粒体膜蛋白VDAC1也有明显的保护作用。另外,5mM NAC显著改善肝细胞线粒体的呼吸功能和氧化磷酸化效能,进而提高肝细胞内ATP的含量,抑制p53蛋白和capase-3的活化,降低肝细胞凋亡率。4.自噬诱导剂Rap对Cr(Ⅵ)诱导的线粒体依赖性肝细胞凋亡的影响Cr(Ⅵ)染毒可诱导L-02肝细胞自噬活性的增加,包括自噬蛋白LC3-Ⅱ的聚集,mTOR通路4EBP1蛋白磷酸化表达水平降低。通过透射电镜可直接观察到包裹着受损线粒体的自噬体,自噬关键基因Beclin-1和Atg7的mRNA表达水平增加。1.5μM Rap对4μM Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞生存率的降低有显著的保护作用,而5mM3-MA可诱导肝细胞生存率进一步降低。用1.5μM Rap和5mM3-MA干预Cr(Ⅵ)染毒肝细胞的过程,结果发现通过上调自噬活性,能有效保护Cr(Ⅵ)诱导的线粒体功能的损伤,包括线粒体膜电位、线粒体呼吸功能、氧化磷酸化效能及ATP生成等。并且上调自噬活性还可抑制Cr(Ⅵ)诱导的p53蛋白和caspase-3的活化和细胞凋亡率的增加。而抑制自噬活性会进一步加重线粒体功能损伤和细胞凋亡。结论1.Cr(Ⅵ)可诱导L-02肝细胞线粒体依赖性凋亡。Cr(Ⅵ)染毒会导致肝细胞线粒体损伤,能量代谢障碍,p53蛋白活化,caspase-3活性增加,最终导致肝细胞凋亡。2.线粒体MPT抑制剂CsA通过抑制线粒体PTP的开放,减轻线粒体呼吸功能损伤,提高线粒体氧化磷酸化效能和ATP含量,进而抑制p53和caspase-3的活化,减少Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞凋亡。3.ROS清除剂NAC可直接清除细胞内过多的ROS,减轻Cr(Ⅵ)诱导的氧化损伤和钙超载,保护肝细胞膜上Ca2+通道活性,减轻线粒体损伤,进而拮抗Cr(Ⅵ)诱导的线粒体依赖性肝细胞凋亡。4.激活细胞自噬活性有利于保护Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞凋亡。上调肝细胞自噬活性,可以及时清除受损的线粒体,有利于线粒体的更新和正常功能的维持,而抑制线粒体依赖性细胞凋亡的发生。