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背景与目的：
慢性蠕虫感染通常与炎症性疾病以及过敏性疾病的发病率降低相关。已有报道指出蠕虫感染可通过诱导调节性B细胞(Regulatory B cells，Breg)进而抑制过敏性炎症，IL-10在这一过程中起着关键作用。近年来，在实验动物模型以及自身免疫和感染性疾病患者中的研究中鉴定了数个具有不同免疫抑制功能的Breg细胞亚群，如：过渡2期-边缘区前体B细胞(Transitional 2 marginal zone B precursor，T2-MZP)和边缘区B细胞(Marginal zone B cells，MZB)。另外，多项研究表明Breg细胞可通过分泌多种抑制性细胞因子发挥免疫调控作用。然而，在日本血吸虫感染中关于具有潜在免疫调节作用Breg细胞亚群的分化及其作用机制的研究并不充分。由此，在实验性日本血吸虫感染小鼠的不同阶段，我们对B细胞各亚群的分化以及具有免疫抑制潜力分子的表达进行了研究，以探讨日本血吸虫感染诱导调节性B细胞发挥免疫调控的机制。
血吸虫抗原刺激B细胞的多克隆激活是血吸虫感染重要的免疫反应之一，同时血吸虫感染也可诱导B细胞的增殖和免疫调控能力。与曼氏血吸虫抗原体外诱导引起的B细胞活化相比，实验动物血吸虫感染期间B细胞的活化程度更高。不过，在血吸虫感染过程中关于限制过度激活B细胞机制的报道还不多。为了进一步了解血吸虫感染过程中B细胞群体的活化及增殖的变化，我们通过对比正常小鼠与日本血吸虫感染小鼠来源的脾脏B细胞基因表达谱筛选出差异表达基因，并对差异基因进行了生物信息学分析以判断差异基因的表达意义。
材料与方法：
建立日本血吸虫感染BALB/c小鼠的模型，在感染3周、8周及12周后对小鼠脾脏和腹腔的B细胞亚群(B-1a细胞、T1-B细胞、过渡2期-边缘区前体B细胞、边缘区B细胞和滤泡B细胞)的分化以及免疫负调控相关因子(IL-10、TGF-β以及PD-L1等)的表达进行检测。为了进一步研究在日本血吸虫感染急性期B细胞分泌细胞因子的变化，我们将来自正常小鼠和感染8周小鼠脾脏的纯化B细胞在体外培养24h，收集培养上清后进行细胞因子检测。
然后，我们用日本血吸虫可溶性虫卵抗原(Soluble egg antigens，SEA)或可溶性雄虫抗原(Soluble worm antigens，SWA)和正常小鼠来源的腹腔灌洗细胞或纯化的脾脏B细胞共培养进行体外刺激，以及通过腹腔注射SEA或SWA对小鼠进行在体刺激，以研究日本血吸虫抗原对B细胞表达免疫调控因子的诱导作用。
接着，我们用正常小鼠或感染8周小鼠脾脏的纯化B细胞与正常小鼠脾脏来源的纯化CD4+T细胞进行共培养，并通过PD-L1抗体阻断实验，以研究感染脾脏B细胞对CD4+T细胞的抑制活性及机制。
我们也进行了PD-L1在体阻断实验。从日本血吸虫感染后第29天开始，每周2次腹腔注射PD-L1抗体或同种型对照抗体，共处理4周，在感染后56天，通过流式细胞术检测小鼠Th1/Th2反应以及通过组织化学染色和实时定量PCR评估肝脏病理状态，以研究PD-L1在调节血吸虫宿主免疫中的作用。
最后，为了全面了解日本血吸虫感染对宿主B细胞发育及分化的影响，我们对感染8周小鼠和正常小鼠的脾B细胞进行了RNA测序，用R包DESeq2(1.10.1)将两组进行了差异表达分析，对差异表达基因进行GO功能分析(包括BiologicalProcesses、CellularComponents、MolecularFunctions)，并用定量PCR检验了部分差异表达的基因。
结果：
小鼠在日本血吸虫感染后的第3周脾脏各B细胞亚群的比例没有变化；第8周和12周时，T2-MZP和滤泡B细胞(Follicular B cells，FOB)的比例没有显著变化，但B-1a细胞、T1-B细胞和MZB细胞的比例显著降低。随着感染时间的延长，感染小鼠脾脏各B细胞亚群的细胞数量逐渐增加。另外，感染小鼠腹腔B-1a细胞的比例在感染后第3周还没有显著变化，第8周或及12周显著下降。
与正常小鼠相比，脾脏CD19+B细胞PD-L1的表达在感染后第8周和第12周显著增加；而腹腔CD19+B细胞PD-L1的表达在感染后第3周和第8周没有显著变化，但在感染后第12周显著下降。另外，感染过程中MZB细胞PD-L1的表达没有显著变化；而B-1a、FOB、T1-B和T2-MZP细胞亚群的PD-L1表达在感染后第8周和12周均显著增强。
脾脏CD19+B细胞IL-10的表达在感染后第12周显著增加；TGF-β的表达在感染后第8周即显著升高，第12周趋于正常水平。IFN-γ的表达在感染后第8周和12周均显著升高。与脾脏B细胞不同，腹腔CD19+B细胞表达IL-10、TGF-β或IFN-γ的水平在感染后均没有显著变化。此外，感染8周小鼠脾脏B细胞的培养上清液中检测到了更高水平的IL-6、TNF和IFN-γ。
在体外经SEA刺激24h后，脾脏B细胞的CD5、TGF-β、PD-L1和CD23表达显著增强，但IL-10的表达增加并不明显，而CD21的表达则降低。腹腔B细胞的CD5表达未见增加，但TGF-β、PD-L1和IL-10的表达显著增强。SEA体外刺激不影响脾脏和腹腔B细胞IFN-γ的表达。LPS刺激未能增强脾脏B细胞CD5的表达。SWA刺激同样未能诱导脾脏B细胞CD5和PD-L1的表达的增强。
经腹腔注射SEA或SWA免疫小鼠后，SEA能显著增强脾脏和腹腔CD19+细胞PD-L1的表达，以及脾脏CD19+B细胞TGF-β的表达。而SWA对脾脏CD19+B细胞PD-L1和TGF-β的表达均未见影响。
在共培养实验中，感染小鼠来源的B细胞能显著降低CD4+T细胞转录因子T-bet、Gata3和FoxP3的表达，但显著增强了Tfh细胞转录因子Bcl6的表达。在与CD4+T细胞共培养之前，对B细胞进行Anti-PD-L1抗体预处理，结果显示Anti-PD-L1抗体预处理B细胞未能恢复CD4+T细胞的T-bet、Gata3、FoxP3表达，而CD4+T细胞Bcl6的表达进一步显著增强。我们进一步检测了共培养实验中CD4+T细胞表达细胞因子的情况，发现感染小鼠来源的B细胞显著降低了CD4+T细胞IFN-γ、IL-4和IL-10的表达。Anti-PD-L1抗体预处理B细胞未能恢复CD4+T细胞的IFN-γ和IL-10表达，而CD4+T细胞IL-4的表达显著增加。与正常小鼠来源的脾脏B细胞相比，感染小鼠来源的脾脏B细胞使CD4+T效应记忆(TEM，CD44+CD62L-)细胞显著减少。用Anti-PD-L1抗体预处理不影响感染小鼠的B细胞介导的对CD4+T效应记忆细胞的抑制作用，以及正常小鼠B细胞与CD4+T细胞间的相互作用。
与用同型抗体处理的感染鼠相比，在体PD-L1阻断显著增强感染小鼠脾脏CD4+T细胞Gata3、Bcl6和IL-4的表达，并促进CD4+T细胞的增殖，对T-bet、FoxP3、IFN-γ、TGF-β和IL-10的表达无影响。另外，Anti-PD-L1抗体在体阻断对日本血吸虫感染后肝脏中虫卵的沉积无影响；Masson染色和肝脏组织α-SMA和Col1a1的mRNA表达水平的检测结果显示Anti-PD-L1抗体在体阻断并未影响肝纤维化的程度。
转录组分析发现，在感染小鼠脾B细胞中，与体细胞超突变和类别转换重组相关的基因Aicda、Ada、Atad5和Exo1的表达增加。血吸虫感染也促进了脾B细胞与细胞周期相关的基因Cdk1、Ccna2、Ccnb1、Cdkn1a的表达。感染小鼠脾B细胞促凋亡基因Pawr表达水平高，抗凋亡基因Bcl2表达水平低。在差异表达的BCR信号分子中，感染小鼠B细胞的Ighv12-3和大部分Igkv4转录水平均上调。
结论：
我们的研究发现，在日本血吸虫感染后第8周和第12周，小鼠脾脏和腹腔B-1a细胞以及MZB细胞的百分比降低。脾脏B细胞TGF-β的表达在感染第8周增加，然而在第12周恢复至正常水平。脾脏B细胞PD-L1表达在感染第8周和12周升高。在体外实验中，SEA增强脾脏B细胞PD-L1和CD5表达，对腹腔B细胞无此作用。经SEA在体刺激的脾脏和腹腔B细胞表达IL-10和TGF-β。此外，感染8周小鼠的脾脏B细胞在体外抑制Th1和Th2细胞的功能，但是增强了Tfh细胞转录因子Bcl6的表达；在共培养前阻断感染小鼠脾脏B细胞的PD-L1可进一步增强Bcl6在CD4+T细胞内的表达。在日本血吸虫感染小鼠第29天对其进行为期4周的Anti-PD-L1抗体处理，可增强感染小鼠的Th2反应以及Bcl6在CD4+T细胞内的表达，而肝脏病理学变化并不明显。
RNA-Seq分析显示感染小鼠B细胞的促凋亡基因(Pawr和Tnfrsf21)的转录增加，但抗凋亡基因Bcl2的表达降低。因此，尽管血吸虫病感染促进B细胞的增殖，但是它同时调节与凋亡相关的基因的表达，这可能是很少有报道称慢性血吸虫病感染导致B细胞淋巴瘤的原因。血吸虫感染小鼠B细胞Ighv12-3和Igkv4基因的表达增强可能会增加Ighv12-3与Igkv4组合的可能性，进而影响B-1细胞的发育。
总的来说，本研究揭示了日本血吸虫感染调节B细胞亚群的分化和免疫抑制相关分子的表达，进而影响CD4+T细胞的反应。我们的研究有助于更好地了解血吸虫病期间的B细胞免疫反应，并为全面阐明血吸虫感染期间B细胞的活化、增殖和凋亡提供了基础。
慢性蠕虫感染通常与炎症性疾病以及过敏性疾病的发病率降低相关。已有报道指出蠕虫感染可通过诱导调节性B细胞(Regulatory B cells，Breg)进而抑制过敏性炎症，IL-10在这一过程中起着关键作用。近年来，在实验动物模型以及自身免疫和感染性疾病患者中的研究中鉴定了数个具有不同免疫抑制功能的Breg细胞亚群，如：过渡2期-边缘区前体B细胞(Transitional 2 marginal zone B precursor，T2-MZP)和边缘区B细胞(Marginal zone B cells，MZB)。另外，多项研究表明Breg细胞可通过分泌多种抑制性细胞因子发挥免疫调控作用。然而，在日本血吸虫感染中关于具有潜在免疫调节作用Breg细胞亚群的分化及其作用机制的研究并不充分。由此，在实验性日本血吸虫感染小鼠的不同阶段，我们对B细胞各亚群的分化以及具有免疫抑制潜力分子的表达进行了研究，以探讨日本血吸虫感染诱导调节性B细胞发挥免疫调控的机制。
血吸虫抗原刺激B细胞的多克隆激活是血吸虫感染重要的免疫反应之一，同时血吸虫感染也可诱导B细胞的增殖和免疫调控能力。与曼氏血吸虫抗原体外诱导引起的B细胞活化相比，实验动物血吸虫感染期间B细胞的活化程度更高。不过，在血吸虫感染过程中关于限制过度激活B细胞机制的报道还不多。为了进一步了解血吸虫感染过程中B细胞群体的活化及增殖的变化，我们通过对比正常小鼠与日本血吸虫感染小鼠来源的脾脏B细胞基因表达谱筛选出差异表达基因，并对差异基因进行了生物信息学分析以判断差异基因的表达意义。
材料与方法：
建立日本血吸虫感染BALB/c小鼠的模型，在感染3周、8周及12周后对小鼠脾脏和腹腔的B细胞亚群(B-1a细胞、T1-B细胞、过渡2期-边缘区前体B细胞、边缘区B细胞和滤泡B细胞)的分化以及免疫负调控相关因子(IL-10、TGF-β以及PD-L1等)的表达进行检测。为了进一步研究在日本血吸虫感染急性期B细胞分泌细胞因子的变化，我们将来自正常小鼠和感染8周小鼠脾脏的纯化B细胞在体外培养24h，收集培养上清后进行细胞因子检测。
然后，我们用日本血吸虫可溶性虫卵抗原(Soluble egg antigens，SEA)或可溶性雄虫抗原(Soluble worm antigens，SWA)和正常小鼠来源的腹腔灌洗细胞或纯化的脾脏B细胞共培养进行体外刺激，以及通过腹腔注射SEA或SWA对小鼠进行在体刺激，以研究日本血吸虫抗原对B细胞表达免疫调控因子的诱导作用。
接着，我们用正常小鼠或感染8周小鼠脾脏的纯化B细胞与正常小鼠脾脏来源的纯化CD4+T细胞进行共培养，并通过PD-L1抗体阻断实验，以研究感染脾脏B细胞对CD4+T细胞的抑制活性及机制。
我们也进行了PD-L1在体阻断实验。从日本血吸虫感染后第29天开始，每周2次腹腔注射PD-L1抗体或同种型对照抗体，共处理4周，在感染后56天，通过流式细胞术检测小鼠Th1/Th2反应以及通过组织化学染色和实时定量PCR评估肝脏病理状态，以研究PD-L1在调节血吸虫宿主免疫中的作用。
最后，为了全面了解日本血吸虫感染对宿主B细胞发育及分化的影响，我们对感染8周小鼠和正常小鼠的脾B细胞进行了RNA测序，用R包DESeq2(1.10.1)将两组进行了差异表达分析，对差异表达基因进行GO功能分析(包括BiologicalProcesses、CellularComponents、MolecularFunctions)，并用定量PCR检验了部分差异表达的基因。
结果：
小鼠在日本血吸虫感染后的第3周脾脏各B细胞亚群的比例没有变化；第8周和12周时，T2-MZP和滤泡B细胞(Follicular B cells，FOB)的比例没有显著变化，但B-1a细胞、T1-B细胞和MZB细胞的比例显著降低。随着感染时间的延长，感染小鼠脾脏各B细胞亚群的细胞数量逐渐增加。另外，感染小鼠腹腔B-1a细胞的比例在感染后第3周还没有显著变化，第8周或及12周显著下降。
与正常小鼠相比，脾脏CD19+B细胞PD-L1的表达在感染后第8周和第12周显著增加；而腹腔CD19+B细胞PD-L1的表达在感染后第3周和第8周没有显著变化，但在感染后第12周显著下降。另外，感染过程中MZB细胞PD-L1的表达没有显著变化；而B-1a、FOB、T1-B和T2-MZP细胞亚群的PD-L1表达在感染后第8周和12周均显著增强。
脾脏CD19+B细胞IL-10的表达在感染后第12周显著增加；TGF-β的表达在感染后第8周即显著升高，第12周趋于正常水平。IFN-γ的表达在感染后第8周和12周均显著升高。与脾脏B细胞不同，腹腔CD19+B细胞表达IL-10、TGF-β或IFN-γ的水平在感染后均没有显著变化。此外，感染8周小鼠脾脏B细胞的培养上清液中检测到了更高水平的IL-6、TNF和IFN-γ。
在体外经SEA刺激24h后，脾脏B细胞的CD5、TGF-β、PD-L1和CD23表达显著增强，但IL-10的表达增加并不明显，而CD21的表达则降低。腹腔B细胞的CD5表达未见增加，但TGF-β、PD-L1和IL-10的表达显著增强。SEA体外刺激不影响脾脏和腹腔B细胞IFN-γ的表达。LPS刺激未能增强脾脏B细胞CD5的表达。SWA刺激同样未能诱导脾脏B细胞CD5和PD-L1的表达的增强。
经腹腔注射SEA或SWA免疫小鼠后，SEA能显著增强脾脏和腹腔CD19+细胞PD-L1的表达，以及脾脏CD19+B细胞TGF-β的表达。而SWA对脾脏CD19+B细胞PD-L1和TGF-β的表达均未见影响。
在共培养实验中，感染小鼠来源的B细胞能显著降低CD4+T细胞转录因子T-bet、Gata3和FoxP3的表达，但显著增强了Tfh细胞转录因子Bcl6的表达。在与CD4+T细胞共培养之前，对B细胞进行Anti-PD-L1抗体预处理，结果显示Anti-PD-L1抗体预处理B细胞未能恢复CD4+T细胞的T-bet、Gata3、FoxP3表达，而CD4+T细胞Bcl6的表达进一步显著增强。我们进一步检测了共培养实验中CD4+T细胞表达细胞因子的情况，发现感染小鼠来源的B细胞显著降低了CD4+T细胞IFN-γ、IL-4和IL-10的表达。Anti-PD-L1抗体预处理B细胞未能恢复CD4+T细胞的IFN-γ和IL-10表达，而CD4+T细胞IL-4的表达显著增加。与正常小鼠来源的脾脏B细胞相比，感染小鼠来源的脾脏B细胞使CD4+T效应记忆(TEM，CD44+CD62L-)细胞显著减少。用Anti-PD-L1抗体预处理不影响感染小鼠的B细胞介导的对CD4+T效应记忆细胞的抑制作用，以及正常小鼠B细胞与CD4+T细胞间的相互作用。
与用同型抗体处理的感染鼠相比，在体PD-L1阻断显著增强感染小鼠脾脏CD4+T细胞Gata3、Bcl6和IL-4的表达，并促进CD4+T细胞的增殖，对T-bet、FoxP3、IFN-γ、TGF-β和IL-10的表达无影响。另外，Anti-PD-L1抗体在体阻断对日本血吸虫感染后肝脏中虫卵的沉积无影响；Masson染色和肝脏组织α-SMA和Col1a1的mRNA表达水平的检测结果显示Anti-PD-L1抗体在体阻断并未影响肝纤维化的程度。
转录组分析发现，在感染小鼠脾B细胞中，与体细胞超突变和类别转换重组相关的基因Aicda、Ada、Atad5和Exo1的表达增加。血吸虫感染也促进了脾B细胞与细胞周期相关的基因Cdk1、Ccna2、Ccnb1、Cdkn1a的表达。感染小鼠脾B细胞促凋亡基因Pawr表达水平高，抗凋亡基因Bcl2表达水平低。在差异表达的BCR信号分子中，感染小鼠B细胞的Ighv12-3和大部分Igkv4转录水平均上调。
结论：
我们的研究发现，在日本血吸虫感染后第8周和第12周，小鼠脾脏和腹腔B-1a细胞以及MZB细胞的百分比降低。脾脏B细胞TGF-β的表达在感染第8周增加，然而在第12周恢复至正常水平。脾脏B细胞PD-L1表达在感染第8周和12周升高。在体外实验中，SEA增强脾脏B细胞PD-L1和CD5表达，对腹腔B细胞无此作用。经SEA在体刺激的脾脏和腹腔B细胞表达IL-10和TGF-β。此外，感染8周小鼠的脾脏B细胞在体外抑制Th1和Th2细胞的功能，但是增强了Tfh细胞转录因子Bcl6的表达；在共培养前阻断感染小鼠脾脏B细胞的PD-L1可进一步增强Bcl6在CD4+T细胞内的表达。在日本血吸虫感染小鼠第29天对其进行为期4周的Anti-PD-L1抗体处理，可增强感染小鼠的Th2反应以及Bcl6在CD4+T细胞内的表达，而肝脏病理学变化并不明显。
RNA-Seq分析显示感染小鼠B细胞的促凋亡基因(Pawr和Tnfrsf21)的转录增加，但抗凋亡基因Bcl2的表达降低。因此，尽管血吸虫病感染促进B细胞的增殖，但是它同时调节与凋亡相关的基因的表达，这可能是很少有报道称慢性血吸虫病感染导致B细胞淋巴瘤的原因。血吸虫感染小鼠B细胞Ighv12-3和Igkv4基因的表达增强可能会增加Ighv12-3与Igkv4组合的可能性，进而影响B-1细胞的发育。
总的来说，本研究揭示了日本血吸虫感染调节B细胞亚群的分化和免疫抑制相关分子的表达，进而影响CD4+T细胞的反应。我们的研究有助于更好地了解血吸虫病期间的B细胞免疫反应，并为全面阐明血吸虫感染期间B细胞的活化、增殖和凋亡提供了基础。