对虾白斑综合征病毒(WSSV)可引起养殖对虾的急性、致死性传染病,造成世界范围内对虾养殖业的巨大经济损失。WSSV已成为威胁我国乃至世界对虾健康养殖的重要病原。本研究以WSSV最丰富的囊膜蛋白VP28为靶蛋白构建VP28抗原蛋白枯草工程菌(B.subtilis-VP28);在此基础上对重组菌株芽孢体和营养体进行模拟胃肠道环境和高温环境的耐受性评估以研究产业化最合适的剂型;同时免疫对虾后检测免疫基因(proPO,PE和LGBP)mRNA表达水平和细胞吞噬WSSV活性的变化;并检测其在肠道内的存活和体内的定位分布,从对对虾非特异性免疫机制的影响和口服递呈途径来初步探究B.subtilis-VP28的抗病机理。主要研究内容和结果如下:　　 1.表达VP28的枯草芽孢杆菌(B.subtilis-VP28)的构建　　 在含群体感应启动子LuxⅠ(源自NF003)和木聚肽糖酶信号肽xynA的高效表达重组质粒PW980(来源于B.subtilis pUB110)基础上,利用双酶切位点:PstⅠ、SalⅠ引入VP28基因,构建重组表达质粒PW980-VP28,经双酶切和测序鉴定,证明VP28基因己成功插入到重组质粒PW980中。将B.subtilis1A751作为宿主菌,采用化学法制备感受态细胞,成功将表达VP28的重组质粒转入B.subtilis1A751中,经SDS-PAGE分析发酵24h的B.subtilis-VP28上清液,在28KD左右有一明显的条带,与预计大小一致。表明VP28基因在B.subtilis1A751成功获得胞外分泌表达。　　 2.重组菌株B.subtilis-VP28的耐受性评估　　 用体外模拟胃肠道环境与芽孢存活计数相结合手段,考察重组菌株B.subtilis-VP28营养体和芽孢体耐受对虾胃肠道环境和高温环境的能力。试验结果表明:①重组菌株B.subtilis-VP28芽孢在不同的pH环境中都表现出很强的耐受性和良好的生长增殖趋势,而营养体的耐受性较差;②在含不同浓度胰蛋白酶的模拟肠液中芽孢和营养体均能表现出良好的耐受性,其中芽孢的耐受能力更为显著;③当温度高达80℃时,仍有93.9％的芽孢存活,而营养体基本失活。这些特点使重组菌株B.subtilis-VP28芽孢体可成为口服疫苗递呈VP28至胃肠等极端环境的理想剂型。　　 3.重组菌株B.subtilis-VP28免疫对虾后对免疫基因mRNA表达水平和细胞吞噬活性的影响　　 重组菌株B.subtilis-VP28免疫凡纳淀对虾,同时设立B.subtilis-VP28发酵上清液(主要是VP28);B.subtilis;NaCl对照组,采用SYBR Green I荧光定量PCR检测免疫基因proPO,PE和LGBPmRNA的表达水平,同时采用FITC标记的WSSV进行血细胞吞噬WSSV活性的检测,进一步揭示B.subtilis-VP28表达系统对对虾非特异性免疫的影响。试验结果表明:在免疫后的第3d.B.subtilis-VP28菌液能显著影响对虾proPO,PE和LGBP mRNA的表达水平和细胞对WSSV的吞噬活性,B.subtilis菌液组相比较B.subtilis-VP28发酵上清液组也对proPO,PE和LGBP免疫基因和细胞吞噬活性有一定的增强作用,NaCl组则基本没有变化。说明重组菌株B.subtilis-VP28能激发对虾的非特异性免疫应答,而枯草芽孢杆菌系统本身作为益生菌对对虾的免疫机制也有一定的激活作用。　　 4.重组菌株B.subtilis-VP28在对虾肠道内的存活和体内的定位分布　　 利用VP28蛋白的抗原特异性和芽孢的耐热性,对虾口服免疫重组菌株芽孢后,用计数法对其肠道内容物进行芽孢定植存活情况的检测,同时制作肠道,腺体,心脏和肌肉的冰冻切片,采用免疫荧光染色方法并结合PCR方法和芽孢计数方法研究重组菌株B.subtilis-VP28在对虾体内的递呈情况。结果显示:免疫对虾第7d后在其的肠道内容物中仍能检测到大量的活芽孢,说明芽孢在对虾肠道内是可以存活并生长定植的。三种方法显示对虾免疫3d后在肠道、胃和腺体内能检测到重组菌株.B.subtilis-VP28,而在肌肉中检测不到信号。在免疫的第7d PCR方法和免疫荧光染色方法显示在心脏中也有信号,可能是血淋巴的循环和渗透作用促进了B.subtilis-VP28分泌蛋白在对虾体内的流通。