极地微生物胞外多糖免疫活性的初步研究

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胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞外形成的易与菌体分离的可溶性多糖及多糖复合物,在细胞间信息交换、细胞粘附等方面具有重要作用。在南极中生存着大量可产生胞外多糖的极端微生物,EPS合成系统是南极微生物最常见的保护机制之一,EPS可以降低低温、高盐、强辐射等极端环境条件对微生物自身造成的损害。由于在极端环境下形成的微生物EPS具有不同的特性和功能活性,因此其在食品加工、新药研发等领域具有较大的应用潜力。采用苯酚硫酸法和醇沉法从600余株南极微生物中筛选出10株胞外多糖产量较高的菌株,其编号分别为8-6-6-2、4-1-9-1、20#3、DY2-2、8-11-3-1、29-2、4-3-1、3-3-1-2、4-6-8-1和185,其中菌株3-3-1-2胞外粗多糖产量达0.6g/L。分子鉴定与系统发育分析表明,除菌株4-3-1属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)外,其余9株菌株均属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。根据酶活趋势分析试验结果,初筛实验条件确定为:注射剂量为3mg/mL,分别测定实验第3d和第5d的免疫相关酶活性。大菱鲆非特异性免疫活性初筛试验发现,8株菌产生的EPS均在不同程度上提高了大菱鲆血清中AKP、ACP、T-SOD、CAT和LSZ的活性,表明其对大菱鲆的非特异性免疫活性具有促进作用。EPS20#3在7项初筛指标中有6项效果较好,DY2-2、3-3-1-2、4-6-8-1在7项初筛指标中有4项效果较好,选取该4株菌株产生的EPS,以黄芪多糖为阳性对照进行复筛试验。实验结果表明,EPS20#3和3-3-1-2对大菱鲆血清免疫酶活性的增强效果较好。对大菱鲆抗鳗弧菌感染实验表明,EPS20#3、3-3-1-2的感染率分别为70%和40%,低于对照组的100%。实验结果表明,EPS20#3、3-3-1-2提高了大菱鲆非特异性免疫能力。菌株Pseudoalteromonas sp.3-3-1-2产生的EPS对刺参体腔液非特异性免疫指标和存活率等影响的研究发现,该EPS可以明显提高刺参的免疫性能。注射EPS浓度为4mg/mL的实验组免疫增强效果较为明显,整个试验期间实验组ACP活性比对照组至少提高了14%,最高提高了134%;实验第35d时LSZ酶活最大,该天酶活比对照组酶活提高了96%;第7d,实验组T-SOD活力比对照组提高了132%;28d时,实验组MDA含量比对照组降低了82%;试验期间该实验组的存活率始终维持在100%,远远高于对照组的60%。该结果表明,菌株Pseudoalteromonassp.3-3-1-2产生的EPS可作为免疫添加剂使用。通过单因子实验,确定菌株Pseudoalteromonas sp.3-3-1-2产EPS的最佳碳源为蔗糖,最佳添加量为4%;最佳氮源为酵母浸膏,最佳添加量为5%;最佳培养基初始pH为9;最佳发酵温度为10℃;最佳装液量为150/500mL;最佳接种量为3%。对该菌株产生的EPS进行了DEAE-Sepharose fast flow、G-75与G-50的初步分离纯化,对获得的较纯成分正在进行进一步的分离与鉴定,以期获得其多糖结构。
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