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(?)(Prunus salicina Lindli. var cordata J.Y.Zhang et al.)是原产福建的一类重要核果类果树,果大核小、肉厚汁多,可食率高,在我国南方大面积推广种植,市场前景好,但生产上存在果实外观完好,内部果肉已经发生褐变的问题,严重影响(?)果实的商品价值和市场声誉,制约(?)产业的发展。本研究以不同生长发育时期的(?)果实为材料,提取果肉总RNA,构建均一化全长cDNA文库。根据植物酚类物质代谢网络,找出(?)酚类物质代谢网络中的关键酶,通过编码这些酶的基因同源性比较,设计保守区引物,采用稀释池PCR法,筛选该均一化全长cDNA文库,获得(?)酚类代谢网络中关键酶的候选基因(PsPAL2、PsC4H、 PsCHS、PsCCoAOMT、PsLAR和PsPOD)的cDNA或EST,使用生物信息学软件,对这些基因进行了同源性比较、结构与功能预测；采用染色体步移技术,分离这些基因的5’端调控序列,使用PlantCare软件,找出核心启动子区域,对启动子中的顺式作用元件进行分析；采用实时荧光定量PCR技术,分析了这些基因在(?)果实不同生长发育时期的表达动态；本研究结果对于探明引起(?)果肉褐变的酚类物质代谢关键酶基因的功能、抗褐变育种材料的筛选以及抗褐变基因工程上,具有重要的理论意义和实践价值。试验结果如下：1.采用稀释池PCR法筛选(?)果实均一化全长cDNA文库,获得(?)果实酚类物质代谢网络中关键酶基因的全长cDNA或EST：(?)果实PAL家族新成员(PsPAL2),该基因cDNA全长2414bp,其中5’UTR为107bp,3’UTR为153bp, ORF为2154bp,编码717个氨基酸,PsPAL2编码的蛋白,相对分子量为77898.6D,等电点为6.18,其氨基酸序列与姜翠翠(2012)分离的(?)PsPAL的同源性为98.6%,都含有苯丙氨酸解氨酶-组氨酸解氨酶(PAL-HAL)保守区域,属于裂解酶超基因家族；(?)果实C4H基因cDNA (PsC4H)全长为1772bp,其中5’UTR为103bp,3’UTR为154bp, ORF为1515bp,编码504个氨基酸,相对分子量为57801.2D,等电点为9.09；(?)果实CHS基因cDNA (PsCHS)全长为1442bp,其中5’UTR为7bp,3’UTR为237bp, ORF为1176bp,编码391个氨基酸,相对分子量为42784.4D,等电点为6.12；(?)果实CCoAOMT基因cDNA (PsCCoAOMT)全长1195bp,其中5’UTR为284bp,3’UTR为167bp, ORF为744bp编码247个氨基酸,相对分子量为27893.8D,等电点为5.42；(?)果实LAR基因cDNA (PsLAR)cDNA全长为1625bp,其中5’UTR为150bp,3’UTR为425bp, ORF为1050bp,编码349个氨基酸,相对分子量为38483.1D,等电点为5.40；还获得(?)果实POD基因的EST (PsPOD),该序列长度1143bp,其中3’UTR为407bp, ORF为708bp,编码236个氨基酸。生物信息学分析结果表明,PsPAL2、 PsC4H, PsCHS, PsCCoAOMT和PsLAR所编码的蛋白,都不含信号肽、无跨膜结构、亲水性强,属非分泌蛋白,a螺旋在二级结构中占主要地位,除PsC4H编码的蛋白为不稳定蛋白外,其余均为稳定蛋白,PsPAL2所编码的蛋白定位质膜、微体、内质网和线粒体内膜上,PsC4H所编码的蛋白定位于内质网、质膜、高尔基体和细胞核中,PsCHS编码的蛋白定位于细胞质、微体、线粒体基质和溶酶体中,PsCCoAOMT所编码的蛋白定位于细胞质、溶酶体、线粒体基质和内质网中,PsLAR所编码的蛋白只定位于线粒体上。2采用染色体步移技术,分离(?)果实PsPAL2、PsC4H和PsCHS的5,端调控序列：经测序,PsPAL2、PsC4H和PsCHS的5’端调控序列长度分别为1414bp、779bp和1352bp,经PlantCare在线软件检测,这3个序列都含有基础启动子区域的核心元件(TATA-box和CAAT-box)和GC-motif (厌氧反应)、ABRE (ABA反应)等顺式作用元件,在PsPAL25’端调控序列中还含有ARE(厌氧反应)、TCA-element(水杨酸响应)、TGACG-motif和CGTCA-motif(茉莉酸甲酯响应)、TGA-element (生长素响应)、CCGTCC-motif (分生组织表达)、HSE(热胁迫响应)、TC-rich repeat(胁迫和应激响应)、Skn-1-motif(胚乳表达)、MBS (MYB结合位点)和WUN-motif(伤响应)等顺式作用元件,PsC4H的5’端调控序列还含有G-box(光响应)、I-box(光响应)、CE3(ABA响应)、TGA-element(生长素响应)、HSE(热激响应)、Skn-1-motif(胚乳表达)和MBS (MYB结合位点,干旱诱导响应)等顺式作用元件,在PsCHS5端调控序列中还含有ARE(厌氧反应)、GARE-motif (赤霉素响应)、TGACG-motif (茉莉酸甲酯响应)、TGA-element (生长素响应)、TGA-element (生长素响应)、Aux RR-core(生长素响应)、CAT-box (分生组织表达)、DRE(脱水、低温、盐胁迫响应)、TC-rich repeat(防御和应激响应)等顺式作用元件。3.采用荧光实时定量PCR技术,检测(?)果实酚类物质代谢候选基因(PsPAL2、 PsC4H、PsCHS、PsCCoAOMT、PsLAR和PsPOD)的表达动态：PsPAL2在花后25d表达量最高,以后随着果实的进一步发育,表达量逐渐降低,在果实发育后期几乎不表达；PsC4H在(?)果实整个生长发育过程中,其表达量呈先下降后上升的趋势,花后25d表达量最低,随着(?)果实的进一步发育,表达量逐渐升高,在花后125d表达量最高；PSCHS在(?)整个生长发育期过程中表达量呈下调趋势,花后125d,该基因的表达量几乎为零；PsCCoAOMT在(?)整个生长发育过程表达量差异都不明显,整体呈下降趋势,花后50d表达量最低；PSLAR在(?)整个生长发育过程表达量呈明显的下降趋势,前期高后期低,花后125d表达量最低；PsPOD仅在花后25d表达量高,随着果实的发育表达量降低,到果实发育后期几乎不表达。