研究目的 1.从喉鳞状细胞癌差异性microRNA表达谱中筛选相关的miRNA进行研究;2.利用生物信息学方法预测hsa-miR-301a-3p靶基因并对靶向调控关系加以验证;3.研究hsa-miR-301a-3p和靶基因Smad4在喉鳞癌/癌旁正常黏膜新鲜标本、石蜡标本和细胞株中的表达情况及相关性,结合临床病理参数评价它们的临床意义及与预后的关系;4.研究hsa-miR-301a-3p和Smad4对喉鳞癌细胞增殖、克隆、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的影响,明确它们的生物学功能;5.研究hsa-miR-301a-3p和Smad4参与喉鳞癌上皮间质转化的分子生物学机制。研究方法 1.结合文献资料,从课题组已获得的喉鳞癌差异性microRNA表达谱中获取相关的miRNA;2.结合生物信息学方法预测mi RNA的靶基因,利用双荧光素酶报告基因检测的方法验证它们的靶向调控关系;3.利用qRT-PCR和免疫组织化学方法在喉鳞癌/癌旁正常黏膜新鲜标本、石蜡标本和细胞株中的观察hsa-miR-301a-3p和靶基因Smad4表达情况;4.将hsa-miR-301a-3p和Smad4表达情况与临床病理参数、术后随访资料相结合,评价它们的临床意义及与预后的关系;5.采用功能获得和功能缺失的实验方法将构建Smad4过表达载体和商品化的hsa-miR-301a-3p抑制物转染至喉鳞癌细胞,通过MTS法、EdU法、平板克隆形成实验、Transwell法、流式细胞术等技术手段,观察它们对喉鳞癌细胞生物学功能的影响;6.采用westernblot方法观察hsa-mir-301a-3p和smad4对上皮间质转化过程中关键分子的作用;7.采用spss20.0软件进行数据整理,运用多种统计学方法对实验结果进行分析。研究结果1.从microrna表达谱中筛选出上调表达的hsa-mir-301a-3p作为研究对象;2.利用生物信息学方法预测出smad4为hsa-mir-301a-3p的靶基因,成功构建smad4的野生型和突变型3’-utr,双荧光素酶报告基因检测结果证实它们确实存在靶向调控关系;3.在喉鳞癌/癌旁正常黏膜新鲜标本、石蜡标本和细胞株中,hsa-mir-301a-3p表达量增高,smad4表达量降低;4.hsa-mir-301a-3p表达与喉鳞癌患者的t分期相关,smad4表达与喉鳞癌患者的分化程度、颈淋巴结转移相关;5.hsa-mir-301a-3p与smad4两者之间呈负相关性;6.hsa-mir-301a-3p低表达或smad4高表达的喉鳞癌患者预后较好,smad4低表达伴hsa-mir-301a-3p高表达的喉鳞癌患者预后不良;7.抑制hsa-mir-301a-3p表达或恢复smad4表达可显著抑制喉鳞癌细胞的增殖、克隆、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,阻滞细胞于g0/g1期;8.hsa-mir-301a-3p和smad4的表达失调可引起上皮间质转化过程中重要分子变化。研究结论1.喉鳞状细胞癌中存在差异性microrna表达谱;2.smad4是hsa-mir-301a-3p的靶基因,hsa-mir-301a-3p对smad4存在靶向调控作用;3.hsa-mir-301a-3p在喉鳞癌中表达上调,起到癌基因作用,对于喉鳞癌细胞增殖、克隆、迁移和侵袭有促进作用,对细胞凋亡有抑制作用,转染其抑制剂后可将细胞周期阻滞于g0/g1期;4.smad4在喉鳞癌中表达下调,起到抑癌基因作用,对于喉鳞癌细胞增殖、克隆、迁移和侵袭有抑制作用,对细胞凋亡有促进作用,可将细胞周期阻滞于g0/g1期;5.Hsa-miR-301a-3p高表达同时伴有Smad4低表达的患者预后不良;6.Hsa-miR-301a-3p—Smad4参与了喉鳞癌上皮间质转化过程;7.Hsa-miR-301a-3p通过调控其靶基因Smad4参与了喉鳞癌的发生发展和侵袭转移,为今后喉鳞癌的早期诊断、早期治疗和预后评估提供了新的分子标志物。