大豆[Glycine max(L.) Merr.]是一种在世界广泛种植的经济作物，为人类提供了优质的植物蛋白和脂肪。然而，大豆的生产却受到日益严重的病害和虫害的威胁。大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus，SMV)病是一种严重危害大豆生产的病害，在世界范围内普遍发生，往往导致大豆严重减产。斜纹夜蛾[Prodenia litura(Fabricius)]是危害大豆生产的常见害虫，在世界上广泛分布并经常会造成严重的损失，对斜纹夜蛾的抗性已经成为大豆育种的目标性状。研究大豆的抗病虫机制对改善大豆的抗性，提高大豆产量和减少化学杀虫剂对环境的污染等方面都有着重要的意义。　　 microRNA(miRNA)是一类长度约21个核苷酸的非编码小分子RNA，广泛存在于真核生物中，并在转录后水平上调节生物基因的表达。miRNA在生长发育、营养平衡、环境胁迫和病原体响应等生命过程中都发挥着重要的调控作用。如果能够找到在作物抗病抗虫中起到关键作用的miRNA基因并转化植株，将有希望得到优良的耐胁迫转基因新品系。目前人们对大豆miRNA的研究相对较少，并主要集中在与根瘤茵互作相关miRNA的研究方面。对miRNA在大豆抵御生物胁迫方面的研究也鲜见报道。克隆与生物胁迫相关的大豆miRNA，并明确这些miRNA在大豆抗病抗虫中的作用，对提高大豆产量和品质具有现实意义。　　 本研究选取了栽培大豆品种南农1138-2为材料，分别使用大豆花叶病毒和斜纹夜蛾诱导叶片，以磷酸缓冲液处理和未处理的叶片作为对照。利用Solexa测序技术从四个不同处理的大豆叶片材料中获得了17900632条高质量的小RNA序列。基于大豆基因组数据和生物信息学的方法分析得到分属于30个家族的66个新的大豆miRNA。此外，发现了2个大豆的tasiRNA基因。与Sanger的miRNA数据库(miRBase Release14.0)进行比对，验证了其中的34条miRNA，更正了12个位置不准确的miRNA信息，检测到17个miRNA的小RNA产生方式可能与miRNA不符。　　 对42个大豆miRNA家族进行靶标预测，共得到247个靶标基因。这些靶标基因功能广泛，参与到大豆的能量调节、代谢调节、次生代谢、蛋白质的合成降解、细胞结构、信号转导和抗病反应等各个生理过程。采用5 RACE的方法验证了12个大豆miRNA对15个靶标mRNA的剪切。其中3个保守miRNA(miR168、miR395和miR530)，9个为大豆特异的miRNA(miR1510、miR1514、miR1515、miR1535、C3003、C3006、C3009、C3011和C3016-3p)。　　 胁迫处理样品的miRNA表达量与对照样品比较后发现，处理4小时后，大部分miRNA在两种胁迫下表达量增加。其中，C3003、miR394、miR1535、miR160、miR1514和miR393在斜纹夜蛾啃食后发生了明显的上调变化，miR390、C3002、C3010、miR482-5p和C3016-5p表达量下降;miR482-3p、C3009、miR160、miR408、miR530、miR399和C3016-3p在大豆花叶病毒的胁迫下表现为上调，miR390、C5015-3p和miR164表现为下调。　　 采用茎环反转录引物和荧光定量RT-PCR技术，使用TaqMan探针法对miRNA进行了荧光定量分析。分别分析了大豆花叶病毒处理后0h、4h、8h和12h四个时间点的样品miRNA的表达模式。与对照样相比，有5个miRNA在接种SMV以后表现为显著上调(miR160、miR164a、miR393、miR1510b和miR1535)，有2个miRNA(miR1514和C3011)在接种SMV以后的4h、8h和12h均没有发生变化，有一个miRNA(C3010)总体表现为下调趋势。在8个被检测的miRNA中，有6个miRNA在处理第4小时时定量的结果与Solexa测序结果一致。斜纹夜蛾诱导后的miRNA表达模式荧光定量分析发现，在检测的12个miRNA中，有6个miRNA(miR160、miR393、miR1514、miR1535、C3003和C3011)诱导后表达量总体表现为显著上调。3个miRNA(miR530、C3009和C3010)在诱导后表现为显著下调。3个miRNA(miR164a、miR172a和miR1510b)在斜纹夜蛾诱导后表达量没有发生显著变化。用于检测的12个miRNA中，有11个(miR160、miR164a、miR172、miR393、miR1510b、miR1514、miR1535、C3003、C3009、C3010和C3011)与Solexa测序结果的表达量变化方向一致，有1个miRNA(miR530)的荧光定量结果与Solexa测序结果不同。　　 本研究发现并通过荧光定量PCR验证了7个靶标参与大豆的防御机制并且响应大豆花叶病毒或斜纹夜蛾胁迫的miRNA。它们的靶标包括生长素信号路径相关蛋白、R蛋白、酶蛋白和酶抑制蛋白基因。其中，3个miRNA(miR160、miR393和miR1535)在两种胁迫中具有相同的响应模式，3个miRNA(C3009、C3010和C3011)只在斜纹夜蛾诱导下响应，1个miRNA(miR1510)只在SMV诱导下响应。　　 本研究获取的对生物胁迫响应的miRNA为研究大豆miRNA在生物胁迫下的调节机理打下了基础，最终为大豆的抗虫抗病品种的选育工作提供一定的理论基础和优质基因源。