第一部分细菌脂多糖诱导的小鼠全身系统性炎症对骨再生的影响目的：骨折修复有赖于骨骼系统和免疫系统的密切配合。在诸如某些病理情况如多发性创伤,糖尿病,风湿性关节炎,肥胖,衰老等某些基础炎症水平高于正常的情况均能导致骨再生的速度和质量下降。本实验的目的在于应用细菌脂多糖构建一种高基础炎症状态模型,以探讨单纯炎症状态下骨折愈合的细胞生物学机制。方法：对10周大C57BL/6老鼠用三点加压模型造成非稳定性骨折后,连续7天经腹腔注射LPS(3μg/天/老鼠),对照组老鼠注射同等剂量的LPS。分别在骨折的第1天,第3天,第7天,第10天,第14天,第21天心脏采血法收集血浆,并收集骨折侧肢体。用双抗体夹心ELISA方法检测血浆中IL-6水平。骨折侧肢体经过固定,脱钙,透明,石蜡包埋后进行石蜡切片。间隔10张切片分别行Hall Bryant染色。显微镜计算每张切片上骨痂大小及成分。选取Cab2T3和ADTC5两种细胞系分别在不同浓度LPS存在下进行成骨化和成软骨化诱导,应用茜素红和阿尔新蓝染色判断成骨化和成软骨化程度。结果：LPS连续7天注射后,LPS组老鼠未出现明显发热,体重降低,活动减少等症状。血清学检测发现,在骨折后24小时LPS与PBS对照组血浆内IL-6水平达到峰值,但是LPS组IL-6峰值水平远高于PBS对照组。骨折后3天,对照组血浆中炎性因子即恢复至基础水平,但是LPS组在7天时才缓慢恢复至基础水平。体内实验结果表明,在骨折后第7天,第10天和第14天,LPS组骨痂大小较对照比明显减小。新生软骨和新生骨体积LPS组也显著小于对照组,但软骨减少更为明显。细胞实验结果提示,LPS能明显抑制成骨作用和成软骨化作用。结论：通过腹腔注射LPS可以系统性基础炎症水平增高,系统性炎症水平升高能导致局部骨再生减缓,同时影响骨再生质量。第二部分骨折修复过程中巨噬细胞的作用及其表型演变目的：骨折发生后,正常机体能有效募集各种炎性细胞对组织损伤相关刺激进行应答,清除炎症并启动组织修复程序。巨噬细胞作为先天性免疫系统的重要的效应细胞,能发挥清除坏死组织,吞噬细胞碎片,提呈抗原等作用。此外,巨噬细胞能根据细胞外微环境尤其是周围组织炎症水平呈现不同的极化状态,表现不同的生物学功能。在上皮组织伤口愈合中,巨噬细胞的极化和功能变化已经大量见诸报道,本研究旨在应用Ccr2-/-基因缺陷型老鼠研究巨噬细胞在骨折愈合过程中的作用以及在骨折过程中的表型的动态改变。方法：实验采用10周大小的Ccr2-/-老鼠作为干预组,年龄与性别相匹配的正常C57BL/6老鼠作为对照组,判断Ccr2基因在骨折愈合过程中的作用。运用Yet40和Yarg两种YFP荧光标记老鼠来判断骨折愈合不同阶段M1和M2的数量。三点加压法制造非稳定性骨折后,不同时间点收集骨折侧肢体,经过固定,脱钙,透明,石蜡包埋后进行石蜡切片,间隔10张切片分别行Hall Bryant染色,显微镜下计算每张切片上骨痂大小及成分。另选取每10张组织切片行免疫组织化学染色,计数巨噬细胞和中性粒细胞。骨折后分别于第1,3,5,7,10,14天在显微镜下分离骨痂,提取总RNA,逆转录后用qPCR方法检测M1和M2相关基因。在骨折愈合的第1天和第7天,选取Yet40和Yarg荧光标记鼠组织切片做抗YFP染色探讨骨折修复过程中巨噬细胞的表型转化。结果：骨折后第3天,与正常组相比,Ccr2-/-老鼠骨折局部巨噬细胞明显减少,但是中性粒细胞数量并未出现显著下降。骨折第7天,Ccr2-/-基因缺陷鼠较野生型老鼠相比,骨折后骨痂大小显著性减小(P=0.27),新生骨痂中骨含量和软骨含量两组之间并无明显差异。骨折第14天,骨痂大小无明显差异,对照组新生骨含量明显多于Ccr2-/-缺陷组。骨折后第21天,Ccr2-/-组骨痂中新生骨体积和软骨体积均高于对照组。Yet40和Yarg组实验组提示,骨折后第1天,M1数量明显高于M2,至骨折第7天,结果显示M1巨噬细胞数量减少而M2数量增多。结论：Ccr2基因缺陷老鼠能阻止巨噬细胞向机体损伤部位募集从而导致骨折愈合延缓,新生骨数量和质量明显降低,进一步说明巨噬细胞在骨修复过程中发挥重要作用。骨折愈合过程中,巨噬细胞表型由Ml逐渐向M2表型转变,从促炎症表型向抗炎症表型转变,这一转变对清除创伤后局部炎症,促进组织修复发挥积极作用。第三部分年龄相关性巨噬细胞极化对成骨细胞成骨化作用的影响目的：巨噬细胞作为一种主要的先天性免疫应答细胞和抗原提呈细胞在骨折愈合中发挥重要作用,年龄能影响巨噬细胞的表型和功能,同时巨噬细胞也能根据细胞外微环境的改变而呈现不同的细胞表型。在组织损伤发生后,一般认为巨噬细胞首先呈现促炎表型M1,引发炎症和机体免疫应答,随着炎症的消退,巨噬细胞逐渐转变为一种抗炎表型M2,分泌细胞外基质合成胶原等促进组织修复。本部分研究旨在探讨年龄对巨噬细胞极化状态的影响,以及在这种年龄相关的极化状态下,巨噬细胞与成骨细胞的相互作用。方法：不同年龄组老鼠处死后,收集骨髓中单核细胞。用含有5%CMG12-14细胞系上清液的a-MEM培养基培养单核细胞诱导生成小鼠巨噬细胞。10ng/ml IFN-γ与lOng/ml LPS加入培养基过夜,诱导生成M1型巨噬细胞,1ng/ml IL-4培养12小时诱导生成M2型巨噬细胞。用ELISA方法分别测量细胞培养上清液中有关抗炎因子和促炎因子的浓度。用Giess试剂盒测量M1巨噬细胞上清中的NO含量,用Q-PCR方法检测M2巨噬细胞中的YM1和FIZZ1基因的含量,证实巨噬细胞已活化为目的表型。分别用三种共培养的方式培养巨噬细胞和成骨前体细胞1)标准法混合培养2)条件培养基培养3)Trans-well小室培养。用Q-PCR的方法分别在诱导分化的第3天,第7天,第10天,第14天分别检查成骨分化的相关基因ALP, Colla和Osterix表达情况。在共培养14天后用茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测的方法来判断成骨化作用。结果：18月组小鼠巨噬细胞IL-6水平较10周组明显升高。M1标志物NO和M2标志物YM1和FIZZ1,18月组均高于10周组。Q-PCR结果显示,10周和18周未活化骨髓巨噬细胞对成骨细胞成骨化并未表现出统计学差异性。对于M1巨噬细胞条件培养基培养条件下分化的成骨细胞,早期时间点成骨化相关基因表达水平高于对照,但是晚期时间点表达水平低于同年龄组对照。M2条件培养基下,10周组各个时间点成骨化基因均高于正常,而18周M2组与同年龄组对照并无统计学差异。标准法混合培养体系下,各年龄组茜素红染色显示钙结节并无显著差异。在条件培养基培养和Transwell培养体系下,10周M2组较同年龄M1组相比显著促进钙结节生成。18月组M1和M2组钙结节数量均低于同一年龄正常对照组。结论：体外实验证实衰老组巨噬细胞较正常成年组呈现出一种更高的基础炎性状态,衰老状况下巨噬细胞本身仍然具有向M1和M2极化的能力,并分泌M1,M2特异性标记物的能力。这一研究同样也说明在长期的炎症环境下,成骨细胞成骨作用受损,同时M2巨噬细胞表型能促进成骨细胞分化及成骨作用。因此,调控巨噬细胞的极化可能是促进如衰老,肥胖,糖尿病等某些长期慢性炎症情况下骨折修复再生的关键。