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慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以气流受限不完全可逆为特征的疾病,其发病率高、致残率高、致死率高、社会经济负担沉重,严重威胁人类健康。本课题初步探索符合中医学基础理论的慢性阻塞性肺病急性加重期(acute exacerbationof chronic obstructive pulmonary diseases,AECOPD)大鼠痰湿证动物模型的制备方法和条件,通过大鼠肺功能、细胞因子和炎症介质等变化来初步探讨中药对其作用机制,从而为临床应用提供依据。 目的:成功建立AECOPD痰湿证大鼠模型;通过方证对应和非对应干预,来初步探讨中药对AECOPD痰湿证大鼠模型的作用机制。 方法:大鼠按随机数字表法进行分组:wistar大鼠98只,将动物随机分为7组:对照组、痰湿证组、COPD稳定期组(稳定组)、AECOPD组(急性组)、AECOPD痰湿证组(模型组)、AECOPD痰湿证方证对应组(对应组)、AECOPD痰湿证方证非对应组(非对应组)。①COPD稳定期大鼠模型建立:稳定组、急性组、模型组、对应和非对应组,以上各组经鼻注入浓度为6x108CFU/ml的肺炎克雷伯杆菌菌液,同时进行被动香烟吸入,共12w,建立COPD稳定期大鼠模型;②AECOPD大鼠模型建立:于13w的第4天,急性组、模型组、对应和非对应组,经鼻滴入浓度为18x1016CFU/ml的肺炎克雷伯杆菌菌液,于开始滴菌后4天造成AECOPD大鼠模型;对照组和痰湿证大鼠不进行以上滴菌和烟熏处理。③痰湿证与病证结合模型的建立:痰湿证组、模型组、对应和非对应治疗组均分别从第12w开始寒冷环境中进行刺激持续造成痰湿证证候;其余各组在室温(26±1℃)下饲养。④中医经典方剂反证:对应和非对应组从第14w开始分别采用二陈汤和三子养亲汤(含0.61g生药/ml)、葶贝胶囊(0.476g·Kg-1·d-1)灌胃;其余各组给予室温下的蒸馏水(26±1℃)灌胃。 结果:1.大鼠体温的变化 大鼠体温结果显示,与对照组比较,模型组、痰湿证组、非对应组各组大鼠体温均显著降低(P<0.05);急性组、对应组与稳定组比较无显著性差异(P>0.05);与稳定组比,模型组、痰湿证组、非对应组各组大鼠体温均显著降低(P<0.05),急性组、对应组比较无显著性差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 2.各组大鼠外周血WBC计数及GRA％的变化 各组大鼠外周血WBC计数及GRA%的结果显示,与对照组比较,模型组、急性组、非对应组、痰湿证组WBC计数、GRA%显著增高(P<0.01),稳定组、对应组WBC计数和GRA%无明显差别(P>0.05);与稳定组比较,急性组、痰湿证组、模型组、非对应组显著升高(P<0.01),对应组无明显差别(P>0.05);与急性组比较,模型组、非对应组升高(P<0.05),对应组降低(P<0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 3.各组大鼠BALF及血清细胞因子的变化 3.1.支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中TNF-a、IL-8变化 BALF中TNF-a、IL-8结果显示,与对照组比较,模型组、急性组、非对应组、痰湿证组BALF中TNF-a、IL-8计数显著增高(P<0.01),稳定组、对应组BALF中TNF-a、IL-8计数无明显差别(P>0.05);与稳定组比较,模型组、急性组、痰湿证组、非对应组显著升高(P<0.05),对应组无明显差别(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 3.2.BALF中ICAM-1变化 BALF中ICAM-1结果显示,与对照组比较,痰湿证组、急性组、模型组、非对应组、对应组各组大鼠BALF中ICAM-1明显升高(P<0.05),稳定组、对应组大鼠血浆中ICAM-1无显著差异(P>0.05);与稳定组比较,痰湿证组、急性组、模型组、非对应组大鼠BALF中ICAM-1明显升高(P<0.05),对应组大鼠BALF中ICAM-1无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 3.3.血清中TNF-a、IL-8、CRP变化 血清中TNF-a、IL-8、CRP结果显示,与对照组比较,痰湿证组、急性组、模型组、非对应组各组大鼠血清中TNF-a、IL-8、CRP明显增高(P<0.05,P<0.01),稳定组、对应组无显著差异(P>0.05);与稳定组比较,急性组、模型组、痰湿证组、非对应组各组大鼠血清中TNF-a、IL-8、CRP明显增高(P<0.05,P<0.01),对应组无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 4.甲状腺轴和肾上腺素中相关指标变化 4.1.血清FT3、FT4变化 血清中FT3、FT4结果显示,与对照组比较,痰湿证组、模型组、非对应组各组大鼠血清FT3、FT4明显降低(P<0.05,P<0.01),急性组、稳定组、对应组无显著差异(P>0.05);与稳定组比较,痰湿证组、模型组、非对应组大鼠血清FT3、FT4明显降低(P<0.05,P<0.01),对应组大鼠无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 4.2.血清Cor变化 血清Cor结果显示,与对照组比较,痰湿证组、模型组、非对应组各组大鼠血清Cor明显升高(P<0.05),加重组、稳定组、对应组无显著差异(P>0.05);与稳定组比较,痰湿证组、模型组、非对应组大鼠血清Cor明显升高(P<0.05),对应组大鼠血清Cor无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 4.3.血清肾上腺素(E)变化 血清E结果显示,与对照组比较,痰湿证组、急性组、模型组、非对应组各组大鼠血清E明显降低(P<0.05,P<0.01),稳定组、对应组无显著差异(P>0.05);与稳定组比较,痰湿证组、模型组、非对应组大鼠血清E明显降低(P<0.05,P<0.01),对应组大鼠无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 4.4.血清去甲肾上腺素(NE)变化 血清NE结果显示,与对照组比较,痰湿证组、加重组、模型组、非对应组各组大鼠血清NE明显升高(P<0.05),稳定组、对应组无显著差异(P>0.05);与稳定组比较,痰湿证组、模型组、非对应组大鼠血清NE明显升高(P<0.05),对应组大鼠无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 5.大鼠肺功能指标变化 5.1.大鼠呼吸频率(f)变化 大鼠f结果显示,与对照组比较,痰湿证组、急性组、模型组、非对应组各组大鼠f明显加快(P<0.05,P<0.01),稳定组、对应组无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 5.2.大鼠吸气阻力(Rin)变化 大鼠Rin结果显示,与对照组比较,痰湿证组、稳定组、急性组、模型组、非对应组、对应组各组大鼠Rin明显升高(P<0.05);与稳定组比较,痰湿证组、急性组、模型组、非对应组大鼠Rin明显升高(P<0.05),对应组大鼠Rin无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 5.3.大鼠MV、Vt和PEF变化 大鼠MV、Vt和PEF变化结果显示,与对照组比较,痰湿证组、稳定组、急性组、模型组、非对应组各组大鼠MV、Vt和PEF明显降低(P<0.05,P<0.01),对应组无显著差异(P>0.05);与稳定组比较,急性组、模型组、痰湿证组、非对应组各组大鼠MV、Vt和PEF明显降低(P<0.05,P<0.01),对应组无显著差异(P>0.05);与非对应组比较,对应组显著改善(P<0.05),模型组无显著差异(P>0.05)。 6.大鼠肺组织病理变化 普通病理形态学观察,对照组大鼠为正常肺组织;COPD稳定期组大鼠支气管炎症细胞浸润明显,见局灶性肺泡隔破坏,多个肺泡相互融合形成肺气肿;AECOPD组除COPD稳定期组所见外,部分肺实变,小动脉周围水肿明显,小动脉管壁较明显增厚;痰湿证组大鼠杯状细胞增多,粘膜层、粘膜下层大量炎细胞浸润;AECOPD痰湿证组除AECOPD组所见外,大鼠气管上皮细胞破坏明显,支气管平滑肌增厚,管腔堵塞,部分肺实变;AECOPD痰湿证对应组较AECOPD组和AECOPD痰湿证组明显减少;AECOPD痰湿证非对应组病理改变与AECOPD痰湿证组比较加重。 结论:①本课题基于病证结合的现代中医诊疗模式,在COPD发病的中、西医病因学理论指导下,成功复制了AECOPD痰湿证证大鼠模型。本模型的复制方法综合了病和证的研制方法,运用了与AECOPD痰湿证证的形成过程中较为密切的多种致病因素,符合AECOPD痰湿证证形成的条件和病机。②通过大鼠肺功能仪检查、放免测定、普通病理等技术,以多指标、同时观察的方法,对造模动物进行了实验观察及经典中医方剂反证,在症状表现方面,基本符合该病证的临床表现,微观指标如肺组织病理形态学、肺功能、炎症因子等结果基本符合AECOPD及以痰湿证为主的病证表现。③方证对应(中药复方二陈汤和三子养亲汤)抑制炎性介质IL-8、TNF-a、CRP等炎症因子的释放,通过肾上腺-甲状腺轴调节,上调血清FT3、FT4、Cor、E、NE,从而缓解AECOPD痰湿证模型急性加重的症状;非对应(葶贝胶囊)组急性加重症状改善不明显,证明了AECOPD痰湿证模型建立的可靠性,为中医对AECOPD疾病证候的现代研究及中医辨证的客观化初步提供了实验依据。