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研究背景 肾病综合征是常见的,严重威胁人类健康的慢性临床症候群,后天原发性肾病综合征居其中的绝大部分。大量蛋白尿是肾病综合征病人所有病理生理改变的基础,其发生可能与遗传背景、免疫异常及肾小球滤过膜异常等因素有关。肾病综合征发病的遗传因素研究在近年来有了很大的进展。 Nephrin是第一个被证实定位于SD的蛋白成分,是一种新的免疫球蛋白的超家族跨膜蛋白,分子量约135KD,含1241个氨基酸。Nephrin高度特异性地表达于肾小球上皮细胞足突间的SD上,人体其他组织仅大脑及胰腺有少量低度表达。 法国Antignae等2000年报道在家族性常染色体隐性遗传性局灶节段性肾小球硬化病例(FSGS)中发现了Podocin。其编码基因NPHS2的缺失可导致常染色体隐性遗传激素抵抗型肾病综合征,特征性地表现为儿童早期就出现的蛋白尿并迅速发展为终末期肾病。 CD2相关蛋白(CD2AP,CD2-associated protein),是1998年首次发现的一种分子量约80KD、富含SH3结构的连接蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员。其主要功能是通过SH3结构与CD2的结合,起到稳定T细胞与抗原呈递细胞的相互结合,从而使抗原递呈得以进行。但近年来的研究发现,CD2AP也是足浙江大学博士学位论文细胞分子之一,是维持肾小球滤过屏障生理完整性的重要成分。有众多动物实验表明,CDZAP功能异常和/或基因突变与蛋白尿发生有关。 由于临床上原发性肾病综合征是最常见的,而先天性肾病综合征只占其中的一小部分;而且,Nephrin是最早发现的、也是最重要的裂孔隔膜分子:Podocin的变化可能与后天某些类型的肾病综合征发病密切相关;而CDZAP的临床研究很少,同时CDZAP是一个免疫分子。所以,本研究拟以儿童原发性肾病综合征患者为研究对象,采用聚合酶链反应(PCR)及测序技术分析Nephrin、Podocin及CDZAP基因病人外周血淋巴细胞基因组DNA的序列变化;采用实时荧光定量pCR技术(Qu田滋itative Real一time pCR)分析NePMn及CDZAP基因在病人活检肾组织中mRNA水平的表达变化,采用间接免疫荧光、激光共聚焦显微镜及免疫组化等方法分析NeP而n、Podocin及CDZ妙基因在病人活检肾组织中蛋白质水平的表达变化,以探讨肾病综合征病人大量蛋白尿发生与NeP而n、Podocin及CDZ妙基因突变及表达变化的关系,为探讨肾病综合征发病的遗传背景与免疫紊乱的分子机制,为肾病综合征临床治疗提供理论依据及研究方向。研究材料及方法研究对象 以本院2002年1月一2005年4月就诊、入院的原发性肾病综合征病人为研究对象。其中,60例原发性肾病综合征患者进行外周血淋巴细胞基因组DNA中Nep而n、cDZ”基因突变和/或多态性变化;30例肾病综合征患者进行病人活检肾组织中mRNA水平的表达变化分析;20例肾病综合征患者进行病人活检肾组织中蛋白质水平的表达变化分析。上述病例发病时年龄均在1岁以上,排除各类遗传性疾病的家族史,排除乙型肝炎病毒相关性肾炎、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病、系统性高血压等疾病史,排除其他各药物、理化因素引起的肾脏病变导致的大量蛋白尿。研究方法:一、外周血淋巴细胞基因组DNA突变的分析1、外周血淋巴细胞的分离浙江大学博士学位论文2、基因组DNA抽提3、PCR反应①引物设计:②PCR反应条件按文献适当修改。4、电泳缓冲液及染色剂5、电泳方法6、测序二、活检肾组织中Nep而n及CDZAP基因mRNA表达差异的分析1、活检肾组织进行总RNA抽提2、从mRNA一cDNA的逆转录过程:3、质粒构建质粒构建用以建立荧光定量PCR的标准曲线。引物由上海博亚公司合成。(1)引物设计:各设计一对跨越数个内含子的引物。(2)PCR初步扩增(3)T-A克隆4、荧光定量PCR(l)引物和探针设计:各设计一对引物跨越二个内含子。(2)荧光定量PCR反应:三、肾组织原位NePhrin、Podocin及CDZAP蛋白质水平表达变化的分析1、间接免疫荧光法2、激光共聚焦显微镜:3、免疫组化方法四、统计分析 患儿一般情况及肾组织CDZ妙和NeP而n的mRNA表达比较采用独立样本t检验分析。采用两样本等级和检验(Mann一Whiiney Test)分析肾病患者及单纯性血尿患者活检肾组织CDZ”、Podocin和Nep城n蛋白质表达变化。P<0.05认为差异具有统计学显著性意义。浙江大学博士学位论文研究结果一、外周血淋巴细胞基因组DNA突变的分析 所有原发性肾病综合征病例中未发现严重的插入、缺失引起框架漂移或提前终止等突变情况。1、发现有NPHsl基因突变的原发性肾病综合征患者①外显子8和外显子9之间的内含子区域:有纯合子也有杂合子,7906G~A:33#、51#、57#、65#、82#、91#、92#、93#、98#共9个标本。②外显子8和外显子9之间的内含子区域:7892C一 T: 77#。③外显子11编码区:错义突变,杂合子,1358A一G,Q453R,72#。④外显子17编码区:同义突变,杂合子,2223C一T,T74lT:1#、16#、34#、54#、76#、83#、86#、88#共8个标本。⑤外显子17编码区:同义突变,纯合子,2289C一T,V763V:1#、11#、16#、21#、27#、34#、54#、57#、60#、62#、70#、71#、76#、78#、83#、86#、88#、92#共18个。这个突变在dbSNP已有报道。⑥外显子18?