第一部分大鼠骨髓间充质干细胞提取、扩增及功能鉴定目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞提取、扩增及功能鉴定方法:全骨髓贴壁法从Lewis大鼠骨髓中分离并培养扩增出骨髓间充质干细胞。在细胞培养过程中,观察大鼠BMSCs形态及生长增殖情况变化。流式细胞检测传代至第四代的大鼠BMSCs表面抗原CD29、CD105、CD34、CD45及MHC-Ⅱ的表达;体外诱导骨髓间充质干细胞向成脂、成骨方向分化以鉴定细胞类型;检测骨髓间充质干细胞活力以及生长曲线检测;建立混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)体系,检测骨髓间充质干细胞对T细胞增殖能力的影响。结果:大鼠来源的骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,干性稳定。原代细胞传代纯化至第四代时,细胞形态均一,排列紧密,呈梭形,类似成纤维细胞且细胞生长旺盛。细胞表型鉴定结果显示:大鼠BMSCs阴性表达CD34、CD45和MHC-Ⅱ,阳性表达CD29和CD105。在特定的诱导下BMSCs可以向成骨、成脂方向分化。MLR显示大鼠BMSCs对DCs诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用。结论:本实验所培养的大鼠BMSCs符合间充质干细胞鉴定标准,且能够在短时间内获得形态、性质稳定且活性高的细胞,并且证实BMSCs具有较强的免疫调节作用,能抑制异体淋巴细胞增殖分裂能力。第二部分不同年龄段Lewis大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性比较目的:探讨不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的改变以及年龄对骨髓间充质干细胞的影响方法:本实验选取幼年(1月龄)、中年(9月龄)、老年(18月龄)三个年龄段Lewis大鼠,从其骨髓内获取骨髓间充质干细胞。分别取三个年龄段大鼠骨髓间充质干细胞F4代,观察其细胞形态变化、细胞表面标志及细胞凋亡情况。体外行成骨、成脂诱导分化,比较三者成骨、成脂诱导分化能力。透射电镜观察三者形态和结构变化。RT-PCR和Western blot检测三个年龄段大鼠F4代骨髓间充质干细胞中TERT、β-catenin、P16、P21、PCNAmRNA 和蛋白的表达情况。结果:F4代幼年和中年大鼠BMSCs,细胞形态均一,排列紧密,呈梭形,细胞生长旺盛;而老年大鼠BMSCs为圆形、梭形、多角形混合,细胞生长稀疏。MTT法检测F4代幼年、中年、老年大鼠BMSCs吸光度值并无明显统计学差异;而细胞培养至F9代时,幼年和中年大鼠BMSCs仍然有良好的增殖能力,老年大鼠BMSCs增殖能力明显下降;细胞培养至F15代时,幼年大鼠BMSCs吸光度值也有所下降,老年大鼠BMSCs增殖能力则十分微弱。透射电镜结果显示老年大鼠BMSCs细胞核有固缩、凋亡现象,且胞质内出现较多空泡。成骨、成脂诱导分化结果显示幼年大鼠BMSCs诱导出的脂泡数和钙结节数明显多于中年和老年大鼠BMSCs,老年大鼠BMSCs诱导出的脂泡数和钙结节数明显少于幼年和中年大鼠BMSCs。QT-PCR和Western blot结果显示幼年大鼠BMSCs高表达TERT、β-catenin和PCNA,低表达P16和P21;老年大鼠BMSCs低表达TERT、β-catenin和PCNA,高表达P16和P21。结论:随着鼠龄的增长,BMSCs增殖能力有所下降;且随着培养时间的延长,幼年大鼠BMSCs也会发生衰老,增殖能力也逐渐下降。幼年、中年、老年大鼠BMSCs均有向成骨和成脂分化的潜能,但随着鼠龄的增加,BMSCs诱导成骨和成脂分化能力减弱,即BMSCs多向分化潜能减弱。上调TERT、β-catenin和PCNA以及下调P16和P21的表达可能成为BMSCs发挥抗衰老治疗的重要靶点。第三部分不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞对同种异体气管移植物保护效应及其对OB治疗效果的研究目的:不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞对同种异体气管移植物保护效应及闭塞性细支气管炎(OB)治疗效果的研究方法:建立同种异体大鼠异位气管移植模型模拟肺移植后OB的病理过程,然后分别给予幼年(1月龄)、中年(9月龄)、老年(18月龄)三个年龄段大鼠骨髓间充质干细胞局部输注。移植术后第28天,取各组气管移植物行HE染色评估移植气管组织学及形态学差异,免疫组化检测移植气管中E-cadherin、MMP-9和α-SMA的表达情况,TUNEL染色检测细胞凋亡,免疫荧光检测移植气管中TERT、β-catenin定位,Westernblot检测各气管移植物中TERT、β-catenin、P16、P21、PCNA蛋白的表达,EILSA检测血清中炎性因子的表达,以及检测血清中SOD活性和MDA含量结果:在移植后第28天,同种异体移植物气管上皮未能再生,且发生完全性管腔闭塞,最终发展成为OAD。幼年大鼠BMSCs输注后同种异体移植物纤毛黏膜上皮结构完整,假覆层纤毛柱状上皮和粘膜下腺体几乎覆盖了整个管腔,管腔内几乎没有发生闭塞。中年大鼠BMSCs输注后同种异体移植物纤毛黏膜上皮部分脱落缺失,气管黏膜上皮出现不同程度的脱落,上皮层变薄,管腔少量闭塞。老年大鼠BMSCs输注后同种异体移植物纤毛黏膜上皮大部分坏死脱落,粘膜下增厚,管腔发生部分闭塞。幼年、中年、老年大鼠BMSCs输注组,E-cadherin表达依次降低,MMP-9和α-SMA表达则依次升高。幼年大鼠BMSCs抗凋亡作用最强。免疫荧光显示,β-catenin蛋白主要在假复层纤毛柱状上皮层富集,TERT蛋白主要在黏膜上皮层富集。幼年、中年、老年大鼠BMSCs输注组TERT、β-catenin和PCNA蛋白表达量逐渐降低,但都高于同种异体移植气管;而P16和P21蛋白表达量则逐渐升高,但都低于同种异体移植气管。幼年、中年、老年大鼠BMSCs输注后血清中IL-8和TNF-α浓度均降低。与同种异体移植大鼠相比,幼年、中年、老年大鼠BMSCs输注后SOD水平均明显升高,MDA水平均明显下降。结论:成功的建立了大鼠同种异体异位气管移植后慢性排斥反应模型。大鼠BMSCs输注通过抑制移植物气道上皮转间化,抑制移植气管中纤维素形成,减轻细胞凋亡和炎症细胞浸润程度,来促进同种异体移植物上皮修复并预防腔内闭塞,从而减少气道OAD的发生。但随着鼠龄的增加,BMSCs对气管移植物的保护作用逐渐减弱。实验结果表明TERT、β-catenin和PCNA蛋白参与了移植气管的修复与保护,而P16和P21则加重移植气管的损伤。第四部分体外调控不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞及其对气管移植物保护效应与机制的研究目的:探索不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞的调控及其对气管移植物保护效应与机制的研究方法:本实验通过体外分别给予幼年、中年、老年大鼠BMSCs Wnt/β-catenin信号通路激动剂Wnt3a及抑制剂DKK1处理48h,观察三个年龄段大鼠BMSCs生物学效应的变化。再于体内研究经Wnt3a及DKK1处理的三个年龄段大鼠BMSCs对同种异体移植气管的作用。结果:经Wnt3a处理后,幼年、中年、老年大鼠BMSCs分裂增殖能力增加,诱导成骨成脂分化能力加强,对同种异体气管移植物保护效应增强。而通过DKK1处理48h后,幼年、中年、老年大鼠BMSCs分裂增殖能力减弱,诱导成骨成脂分化能力减弱,对同种异体气管移植物保护效应减弱。QT-PCR和Western blot结果检测发现,经Wnt3a处理后,幼年、中年、老年大鼠BMSCs高表达TERT、β-catenin和PCNA蛋白,低表达P16和P21蛋白。而经DKK1处理后,幼年、中年、老年大鼠BMSCs表达TERT、β-catenin和PCNA蛋白明显受抑制,而P16和P21蛋白表达增加。结论:Wnt/β-catenin信号通路参与幼年、中年、老年大鼠骨髓间充质干细胞的调控,并影响其体内、体外生物学效应。激活Wnt/β-catenin信号通路,幼年、中年、老年大鼠骨髓间充质干细胞分裂增殖能力增加,诱导成骨成脂分化能力加强,对同种异体气管移植物保护效应增强。而抑制Wnt/β-catenin信号通路,幼年、中年、老年大鼠骨髓间充质干细胞分裂增殖能力减弱,诱导成骨成脂分化能力减弱,对同种异体气管移植物保护效应也随之减弱。且Wnt/β-catenin信号通路可以通过调控TERT、β-catenin、PCNA、P16和P21的表达来调控幼年、中年、老年大鼠BMSCs的生物学特性及其对气管移植物的保护效应。