研究背景与目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是源自肝细胞的恶性肿瘤,是原发性肝癌中最常见的一种病理类型,世界上平均每年死于HCC的人数约有1,250,000,HCC的发生、发展是一个多基因参与的复杂过程。目前针对HCC的治疗,主要是外科手术切除病灶或者是通过介入手段进行局部化疗栓塞治疗,对HCC患者进行放疗和全身化疗的疗效均不理想。随着分子生物学的发展,免疫治疗和基因治疗等生物治疗方法作为继手术、化疗、放疗之后的第四种治疗模式,日益受到重视。GRIMs(genes associated with retinoid-IFN-induced mortality)是新近由Kalvakolanu在研究干扰素(interferon, IFN)和维甲酸(retinoic acid, RA)合并诱导细胞凋亡时发现的一组参与细胞凋亡的基因,共24种,GRIM-19是其中最具代表性的一种。GRIM-19编码含144个氨基酸残基的蛋白质,分子量约16KD,定位于19p13.1,是一种保守基因,可以在多种正常组织中表达。目前GRIM-19蛋白的细胞定位存在争议,有研究认为GRIM-19主要定位于细胞核,也有研究认为GRIM-19主要表达于胞浆中的线粒体。Lu fei等则认为GRIM-19的定位因细胞种类不同而存在差异,目前国内外对GRIM-19在肝癌组织中的表达及功能都尚未见报道。研究表明,GRIM-19参与细胞增殖、凋亡的调控过程,该基因表达的降低或者位点的突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化,GRIM-19在肝细胞癌变的过程中发挥了怎样的作用,值得我们深入探讨。GRIM-19可以特异性的与组成性活化的STAT3偶联,从而抑制其转录活性,并抑制肿瘤生长,对肿瘤治疗有巨大的潜在价值。这一机制在肾细胞癌、部分前列腺癌、HPV感染的宫颈癌等部分肿瘤组织中都有所报道。但在肝癌方面,只在体外培养的HepG2细胞中有过报道。STAT3可以被多种病毒致癌蛋白所激活,STAT3的组成性活化能促进细胞的恶性转化并阻断其凋亡,促进肿瘤细胞的增殖,血管形成,因此,阻断STAT3勺表达对肿瘤的治疗具有巨大的潜在价值。深入研究GRIM-19与P-STAT3的关系,探讨其对细胞转化、增殖、凋亡的调控机制,将有利于阐明肝癌的发生机制。GRIM-19是由RA和IFNs合并诱导细胞时发现的参与细胞凋亡的基因。维甲酸是维生素A在体内产生的衍生物,属于分化诱导剂类,具有逆转癌前病变,诱导肿瘤细胞分化,提高肿瘤细胞对化疗的敏感性等作用；干扰素则通过与细胞表面受体结合,激活包括JAK-STAT途径、干扰素调节因子在内的多种信号转导途径,直接抑制肿瘤细胞的增殖。在临床上,单用维甲酸和干扰素治疗肿瘤的研究较多,联合治疗肿瘤的研究比较少,两药联合对肝癌细胞的影响及其诱导凋亡的机制尚不清楚。目前针对GRIM-19基因的生物学功能及作用机制的研究尚处于起步阶段,进一步认识其蛋白的功能、调节方式及其作用机制,将为深入了解肿瘤细胞的发生、发展提供新的线索,为肿瘤的诊断、治疗提供新的靶点和研究方向。第一部分GRIM-19及P-STAT3在人肝细胞肝癌中的表达及临床意义研究目的1.检测GRIM-19在原发性肝细胞肝癌和癌旁组织中的表达及定位。2.检测P-STAT3在原发性肝细胞肝癌和癌旁组织中的表达及定位。3.分析GRIM-19及其靶基因STAT3、p-STAT3、VEGF在肝癌和癌旁组织中的相关性。4.分析GRIM-19与原发性肝癌的病因、病理类型、分化程度等临床特征的相关性。研究方法1.收集55例手术之前未经任何治疗的原发性肝癌患者的临床资料及经手术切除的肝细胞癌组织及邻近的非癌肝组织(邻近非癌肝组织：肉眼观正常,且距离肿瘤组织边缘5cm以上),组织标本于手术切除后尽快采集,经脱水、石蜡包埋后切片,采用免疫组织化学染色法,检测GRIM-19和P-STAT3在肝癌组织和非癌肝组织中的表达和定位。2.分别提取肝癌及癌旁肝组织的总蛋白和核蛋白,通过Western Blot的方法检测GRIM-19蛋白的表达情况。3.分别提取肝癌及癌旁肝组织的RNA,通过RT-PCR检测GRIM-19在mRNA水平的表达情况。4.分别提取肝癌及癌旁肝组织的总蛋白,通过Western Blot的方法检测GRIM-19及其靶基因STAT3、p-STAT3、VEGF的表达情况。5.分析GRIM-19与临床病理特征的相关性。结果1.免疫组织化学染色结果判读免疫组织化学染色结果由与本研究无关的两名病理医生评定,每张切片观察5-6个400×视野,计数不少于100个细胞,依据染色强度和阳性细胞数进行分级,染色强度记分为四个等级：阴性：阳性细胞数少于5%,以“-”表示；弱阳性：阳性细胞数在5%-25%之间,以“+”表示；中等阳性：阳性细胞数在25%-50%之间,以“十+”表示；强阳性：阳性细胞数在50%-100%之间,以“+++”表示。2.GRIM-19在肝细胞癌、非癌肝组织中的表达和定位。①免疫组织化学染色结果显示：在非癌肝组织中,GRIM-19蛋白阳性产物主要分布在细胞质,亦有少量阳性产物分布在细胞核,表现为不同染色程度的黄色或棕黄色颗粒；而存肝细胞癌组织中,GRIM-19阳性产物只存在于细胞质。②分别提取肝细胞癌及癌旁组织的核蛋白,Western Blot检测结果显示GRIM-19蛋白在肝癌细胞核蛋白中的表达明显低于癌旁肝细胞的核蛋白(P<0.001).3.GRIM-19在肝细胞癌和癌旁肝组织中的表达水平。①免疫组织化学染色法结果显示：GRIM-19蛋白在肝细胞癌组织中的表达明显低于癌旁肝组织。对照组4例正常肝组织中GRIM-19表达阳性的有3例(3／4,75%)；55例癌旁肝组织中GRIM-19表达阳性的有40例(40／55,72.7%)；而55例肝细胞癌组织中GRIM-19表达阳性的只有25例(25／55,45.5%)。16例不伴随肝纤维化的癌旁组织中有12例GRIM-19表达阳性(12／16,75%)；39例伴随肝纤维化的癌旁组织中有28例GRIM-19表达阳性(28／39,71.8%),不伴随肝纤维化的癌旁组织与伴随肝纤维化的癌旁组织比较,GRIM-19蛋白的表达无明显差异(p>0.05)。GRIM-19在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织(p<0.05),甚至表达缺失。另外,65例GRIM-19表达阳性的肝组织中有23例为++～＋＋+(按结果判读标准分为中等阳性),在这23例中等阳性标本中有20例是癌旁组织(20／23,87%)。②Western Blot和RT-PCR检测,结果进行灰度分析显示：GRIM-19蛋白在肝细胞癌组织中的表达水平明显低于邻近的非癌肝组织(p<0.001)。普通RT-PCR检测结果显示,GRIM-19mRNA在肝细胞癌组织中的表达水平明显低于邻近的非癌肝组织(p<0.001)。QRT-PCR检测结果显示,GRIM-19mRNA在肝细胞癌组织中的表达水平约为癌旁组织的1／6～1／2不等。4. p-STAT3在肝细胞癌、非癌肝组织中的表达及定位免疫组织化学染色结果显示：在肝癌组织中,P-STAT3蛋白阳性产物主要定位在细胞核,多呈散在或灶状分布；P-STAT3蛋白在肝细胞癌组织中的表达明显高于癌旁肝组织。55例肝癌组织中p-STAT3表达阳性的有47例(47／55,85.5%),55例癌旁肝组织中p-STAT3表达阳性的只有14例(14／55,25.5%)。12例组织病理分级为Ⅰ级的肝癌组织中p-STAT3表达阳性的有8例(8／12,66.7%),43例组织病理分级为Ⅱ～Ⅲ级的肝细胞癌组织中p-STAT3表达阳性的有39例(39／43,90.7%),39例非癌肝纤维化组织中p-STAT3表达阳性的有14例(14／39,35.9%),而在16例非癌、非纤维化的肝组织中无p-STAT3的表达阳性者。在61例p-STAT3表达阳性的病例中有40例染色为++～+++(按结果判读标准为中等阳性,40／61,65.6%),在这40例中等阳性的病例中有35例为肝癌组织(35／L40,87.5%)。5. GRIM-19与p-STAT3在原发性肝细胞肝癌及癌旁组织中表达的相关性。提取55例患者肝癌及癌旁组织的总蛋白,通过Western Blot检测了GRIM-19和p-STAT3蛋白的表达情况,条带经灰度值分析,检测结果经配对t检验分析显示：肝细胞癌组织中GRIM-19/β-actin灰度比值(0.29±0.18)明显低于癌旁组织(0.61±0.11)(p<0.05),p-STAT3/β-actin的灰度比值,肝细胞癌中(0.94±0.36)明显高于癌旁组织(0.23±0.12)(p<0.05),两者经Pearson相关检验,相关系数r=一0.59,表明肝细胞肝癌组织中GRIM-19蛋白的表达与p-STAT3蛋白的表达呈负相关,差异有统计学意义(p<0.05)。6. GRIM-19.p-STAT3.STAT3及VEGF在原发性肝细胞肝癌及癌旁组织中的表达。随机抽取了20例患者肝癌及癌旁组织,提取总蛋白,通过Western Blot检测GRIM-19.p-STAT3.STAT3以及p-STAT3的下游蛋白VEGF的表达情况,条带经灰度值分析,检测结果经配对t检验分析显示：肝癌组织中GRIM-19/β-actin灰度比值(0.28±0.12)明显低于癌旁组织(0.64±0.21)(p<0.05)；肝细胞肝癌中p-STAT3/β-actin的灰度比值(0.92±0.27)明显高于癌旁组织(0.31±0.14)(p<0.05),与前期得出的实验结果一致。肝癌组织中STAT3/β-actin灰度比值(0.85±0.13)明显高于癌旁组织(0.32±0.15)(p=0.008)；肝细胞肝癌中VEGF/β-actin灰度比值(0.79±0.21)也明显高于相应的癌旁肝组织(0.36±0.20)(p=0.012)。7.肝细胞癌组织中GRIM-19mRNA的表达水平与临床病理特征的相关性。肝细胞癌组织中GRIM-19勺表达水平与肝癌组织病理分级呈负相关(p=0.001)、血管侵袭呈负相关(p=0.032)、与临床分期呈负相关(p=0.024)；而与年龄、性别、HBV感染、甲胎蛋白(Serum α-fetoprotein).纤维化水平、肿瘤大小、淋巴结转移等其他临床病理特征无相关性。结论1.在正常肝组织中,GRIM-19主要分布在细胞质,少量分布在细胞核；在肝癌组织中GRIM-19表达明显低于癌旁组织,并且出现核表达缺失。2.在肝癌及癌旁组织中,p-STAT3主要分布在细胞核,p-STAT3在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。3.肝细胞肝癌组织中GRIM一19蛋白的表达与p-STAT3蛋白的表达呈明显的负相关。4.肝细胞癌组织中GRIM-19的表达水平与肝癌组织病理分级、血管侵袭、与临床分期呈负相关；而与年龄、性别、HBV感染、甲胎蛋白、纤维化水平、肿瘤大小、淋巴结转移等其他临床病理特征无相关性。第二部分全反式维甲酸联合干扰素β对体外培养的人肝癌细胞增殖、凋亡及GRIM-19分子表达的影响研究目的1.检测GRIM-19在不同的肝癌细胞株中的表达情况。2.探讨维甲酸和干扰素β对肝癌细胞HepG2增殖、凋亡的影响。3.探讨维甲酸和干扰素β对肝癌细胞HepG2GRIM-19表达的影响。4.检测维甲酸和干扰素β对肝癌细胞HepG2GRIM-19的靶基因STAT3、p-STAT3及VEGF表达水平的影响。研究方法1.取传代培养的肝癌细胞株HepG2、MHCC-97H,同时以正常肝细胞株L02作对照,检测三种细胞株中内源性的GRIM-19的表达情况。2.取传代培养的HepG2细胞,实验组加入不同浓度的干扰素β(interferon-β,IFN-β)和维甲酸(retinoic acid, RA),同时设空白对照组,培养不同的时间(24h、48h和72h),通过MTT法检测细胞增殖变化,找到干扰素β和维甲酸抑制肝癌细胞增殖的最适合的浓度和时间。3.取传代培养的HepG2细胞,根据MTT的结果选择适宜的作用时间,加入不同浓度的维甲酸和干扰素β,流式细胞仪检测维甲酸和干扰素β对细胞凋亡的影响。4.取传代培养的HepG2细胞,根据MTT的结果选择适宜的作用时间,加入不同浓度的维甲酸和干扰素β,通过免疫荧光染色比较维甲酸和干扰素β对HepG2细胞中GRIM-19表达的影响。通过Western Bot分别检测实验组和对照组细胞总蛋白和核蛋白中GRIM-19表达水平的变化。5.Western Bot检测实验组和对照组GRIM-19勺靶基因STAT3、p-STAT3及VFGF的表达变化。结果1GRIM-19在不同的肝癌细胞株中的表达1)免疫荧光检测结果显示：正常人肝细胞株L02及肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H中均有内源性GRIM-19的表达,其阳性产物主要定位在细胞质,此外,正常人肝细胞L02亦有少量阳性产物分布于细胞核内,而肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H则无细胞核表达,这一结果与前期肝癌及癌旁组织中GRIM-19蛋白的表达定位一致。另外,肝细胞株L02中GRIM-19的荧光强度明显高于肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H.2)通过Western Blot检测内源性GRIM-19蛋白在正常人肝细胞株L02及肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H中的表达水平,结果显示：内源性的GRIM-19蛋白在正常人肝细胞株L02中表达水平最高,在肝癌细胞株MHCC-97H中表达水平最低,在肝癌细胞株HepG2勺表达水平介于L02细胞和MHCC-9711细胞之间,三组比较,差异具有统计学意义(p<0.001)。而STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白在三种细胞株中的表达,则以MHCC-97H细胞最高,L02细胞最低,HepG2细胞介于L02细胞和MHCC-97H细胞之间,三组比较,差异具有统计学意义(p<0.001)。3)通过RT-PCR检测内源性GRIM-19mRNA在正常人肝细胞株L02及肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H中的表达水平,结果与Western Blot检测结果一致GRIM-19mRNA在正常人肝细胞L02中表达水平最高,在肝癌细胞MHCC-97H中表达水平最低,而在肝癌细胞HepG2中的表达水平介于L02细胞和MHCC-97H细胞之间,三组比较,差异具有统计学意义(p<0.001)。2不同浓度的I FN-β及RA单独或共同作用对HepG2细胞的增殖抑制MTT结果显示：不同浓度的IFN-β、RA单独或联合加入肝癌细胞株HepG2(?)培养液中,对HepG2细胞的增殖均有一定程度的抑制作用,并且呈明显的浓度依赖性和作用时间相关性。此外,联合用药比单独用药对细胞增殖的抑制作用更强,联合用药组对HepG2细胞的增殖抑制率分别与相同浓度相同作用时间的单独用药组比较,差异均具有统计学意义(p<0.05)。我们同时发现IFN-β/RA联合用药浓度过大或作用时间过长均对HepG2细胞有毒性反应,在IFN-β4500u/ml+RA9μmol/L联合作用组和所有72h组均观察到较多的死亡细胞,而在IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L联合作用48h组未看到明显的死亡细胞。因此,在以下实验中,我们选择采用IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作为最佳干预浓度,48h作为最佳干预时间进行实验。3IFN-β/RA联合用药可促进HepG2细胞凋亡流式细胞仪检测结果显示：不同浓度的IFN-β+RA联合加入肝癌细胞株HepG2的培养液中作用48h时,HepG2细胞凋亡指数随药物浓度的增加而增加,对照组llepG2细胞的凋亡指数平均为4.27±1.02, IFN-β500u/ml+RA1μmol/L共同作用48h组,HepG2细胞凋亡指数平均为9.32±1.16:IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L共同作用48h组,HepG2细胞凋亡指数平均为16.34±2.71；IFN-β4500u/ml+RA9μmol/L共同作用48h组,HepG2细胞凋亡指数平均为39.61±6.55。四组凋亡指数比较,差异具有统计学意义(p<0.05)；三个处理组分别与对照组比较,差异均具有统计学意义(p<0.05)。4IFN-β/RA可诱导HepG2细胞内源性GRIM-19表达增加,并出现GRIM-19的核表达阳性1)细胞免疫荧光检测HepG2细胞在IFN-β／RA作用前后GRIM-19蛋白的表达变化,结果显示：对照组HepG2细胞中GRIM-19蛋白主要定位于细胞质,无细胞核表达;而IFN-β／RA处理组除了细胞体积增大外,出现GRIM-19的核表达阳性GRIM-19荧光强度比对照组明显增强,并且随IFN-β／RA浓度增加,GRIM一19蛋白的荧光强度逐渐增强。2)收集经IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作用48h后的HepG2细胞分别提取总蛋白和核蛋白,通过Western Blot检测了GRIM-19蛋白的表达情况,条带经灰度值分析,检测结果经t检验分析显示：实验组总蛋白中GRIM-19/β-actin灰度比值(1.36±0.37)明显高于对照组(0.78±0.21)(p<0.01)；实验组核蛋白中GRIM-19/β-actin灰度比值(0.56+0.19)亦明显高于对照组(0.14+0.05)(p<0.01)。3)收集经IFN-β/RA处理后的HepG2细胞抽提mRNA行RT-PCR检测,结果显示：IFN-β500u/ml+RA1umol/L作用48h时,GRIM-19mRNA表达较对照组增加,约为对照组的1.8倍；当IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作用48h时,GRIM-19mRNA表达约为对照组的3.9倍；当IFN-β4500u/ml+RA9μmol/L作用48h时,GRIM-19mRNA表达程度最高,约为对照组的5.7倍。5实验组GRIM-19的表达增加伴随p-STAT3、STAT3、VEGF的表达下降收集经不同浓度的IFN-β/RA作用48h的HepG2细胞提取总蛋白行Western Blot检测,条带经灰度值分析,检测结果显示：实验组GRIM-19的表达水平均高于对照组(p<0.05),并且GRIM-19的表达量随药物浓度的增加而增加；而p-STAT3、STAT3、 VEGF蛋白在实验组中的表达均明显低于对照组(p<0.05),并且表达水平随药物浓度的增加而降低。结论1.内源性GRIM-19在正常肝细胞株及肝癌细胞株中表达和定位不同。2. IFN-β和RA联合作用可抑制肝癌细胞HepG2增殖,促进其凋亡；同时,还可诱导肝癌细胞内源性GRIM-19的表达,下调p-STAT3介导的VEGF的表达,抑制肝癌的发展。3. GRIM-19有可能成为肝细胞肝癌基因治疗的一个新靶点。