糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，严重危害着人类健康。目前胰岛素注射是临床上治疗糖尿病的主要方法，可以短期内控制血糖。不足之处是需要频繁监测血糖及胰岛素注射，而且不能阻止糖尿病所引起的肾衰、心脏病变、眼底病变、坏疽等并发症。近年来胰腺移植和胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了很大进展，可有效改善患者内源性胰岛素的分泌，改善患者生活状态。胰岛移植最大的问题就是胰岛供体来源不足和终身使用免疫抑制剂。目前解决细胞移植供体不足最有可能的就是干细胞。利用干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞，不仅可以从根本上解决细胞来源问题，还可以克服免疫排斥问题。羊水中存在着多潜能干细胞。人羊水干细胞易于获取，可以从产前诊断的少量羊水中提取；也可以从产后的羊水中分离。而且抽取羊水不会损害母体，也不会对胚胎造成影响，也就不存在伦理和道德上的问题。羊水中的细胞是一群处于胚胎发育早期的细胞群。从中分离的人羊水干细胞(amniotic fluid-derived stemcells, hAFS)细胞是介于胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)和成体干细胞之间的细胞类型，表达ES细胞和成体干细胞的标志，具有相似的多向分化潜能，可以分化为三个胚层的细胞。hAFS细胞体外比较容易培养，其增殖较快，动物体内移植不会形成畸胎瘤，成为干细胞研究的热点。本实验从羊水中分离hAFS细胞，以hAFS细胞为研究对象。研究hAFS细胞的生物学特性，以及多向分化潜能，重点研究其分化为胰岛素分泌细胞的能力。建立及优化hAFS细胞诱导分化的实验方案，探讨诱导后细胞的功能和活性，为其临床应用提供依据。1. hAFS细胞的分离培养和生物学特性从羊水中分离获得hAFS细胞。通过流式细胞仪和免疫荧光测定，hAFS细胞具有ES细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的标志，同时也首次检测到SSEA-1在hAFS细胞中的表达。hAFS在体外可以大量扩增，具有较强的增殖能力。通过细胞周期和端粒酶测定，也证实细胞具有典型干细胞的特点。超微结构发现细胞表面大量的微绒毛，胞内富含丰富的细胞器，说明获得的hAFS细胞功能活跃，具有强蛋白合成的能力，维持自身的增殖和分化。2. hAFS细胞的多向分化潜能本实验对hAFS向脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞三个方向进行诱导分化。通过油红O染色、茜素红染色、Von Kossa’s染色、RT-PCR和免疫组化等实验证实了hAFS细胞在体外特定诱导条件下可以分化为脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞。同时本实验也分析了hAFS细胞的致瘤性。将第3代，第5代，第8代细胞以5×10~6、1×10~7、2×10~7个细胞注射BALB/C裸鼠皮下，观察两个月，未发现肿瘤的形成。说明hAFS细胞动物体内移植不具有致瘤性，这也为临床应用提供可能。3. hAFS细胞分化为胰岛素分泌细胞本实验以胰腺体内发育为依据，诱导hAFS细胞分化为胰岛素分泌细胞。首先bFGF和尼克酰胺联合诱导hAFS细胞分化为胰腺祖细胞。通过检测，这些细胞表达胰腺前体细胞相关的转录因子，例如Pdx-1、Nng3、Pax4。之后加入EGF和exendin-4联合诱导胰腺祖细胞分化为胰岛素分泌细胞。EGF可以有效促进Pdx-1阳性的胰腺祖细胞增殖，exendin-4可促进细胞内分泌方向分化。这些胰岛素分泌细胞表达胰岛相关的转录因子，如Pdx-1、Nkx6.1等，同时表达胰岛功能相关的功能基因，如胰岛素、葡萄糖转运因子和葡萄糖激酶等。最后对这些胰岛素分泌细胞进行葡萄糖刺激试验，发现这些细胞对葡萄糖刺激敏感，根据葡萄糖浓度释放相应的胰岛素。总之，本实验从羊水中分离得到一种新的hAFS细胞，hAFS细胞具有较强的增殖能力和多向分化潜能，体内移植不具有致瘤性。同时高效诱导hAFS细胞分化为胰岛素分泌细胞，这些细胞具有类似成人胰岛的功能和体内发育模式。这为糖尿病临床治疗提供重要的理论和实验基础。