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猪圆环病毒2型（PCV-2）与猪群中发生的多种疾病相关,包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、A2型先天性震颤（CT）等。其中以PMWS最为严重,已经给全世界养猪业带来了很大的经济损失,国内也未能幸免。目前,国内还没有有效的检测试剂盒,快速、特异的检测方法已成为迫切需要。PCV-2的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,由病毒基因组中ORF2基因编码,构成病毒的核衣壳,具有较强的免疫原性,基因序列保守,可应用于临床诊断。本研究则从以下方面研究Cap蛋白,旨在建立PCV-2检测方法,为诊断与该病毒相关的疾病奠定基础。 1.设计一对引物从谈国蕾构建的pcDNA3-ORF2载体中扩增出ORF2基因,并将扩增出的片段插入毕赤酵母表达载体p PICZ。A中,构建成重组质粒p PICZα-ORF2,经甲醇诱导表达、SDS—PAGE、间接ELISA和Western blot试验,结果表明:ORF2基因片段能被分泌表达,且具有良好反应原性。 2.研究了培养条件与表达产量的关系,确定高拷贝重组酵母表达ORF2蛋白的最佳条件为:28-30℃,225rpm振荡培养至BMGY中菌体OD600值为3时,将菌体转入pH7.5的BMMY培养基中使菌体浓度为OD值1.5,培养72h,每24h加入甲醇使终浓度达0.5%。在最佳条件下ORF2蛋白的表达量可达278ug/mL,通过比较不同温度下保存ORF2蛋白的降解率得出酵母培养物上清应保存于-20℃。 3.以ORF2蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪圆环病毒2型抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法的实验步骤进行了优化,优化后的步骤是:42.5μg/mL抗原4℃过夜包被,用1%BSA封闭3h,再与1%BSA稀释的血清作用45min,接着与酶标二抗在37℃作用30min或室温下作用45min,然后用OPD在37℃作用15min或室温下作用20min,最后用0.12%HF终止反应。用此优化方法检测了200份待检猪血清样品。并将其与华中农业大学的圆环病毒病酶联免疫吸附试剂盒方法相比较,检出符合率达到90%,具有广阔的应用前景。