摘要应激是在生物学上被定义为各种生理学的改变,包括内环境失稳态及脑下垂体肾上腺轴的激活。在应激条件下促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin releasing Factor, CRF)由下丘脑释放,激活下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamus pituitarydrenal axis, HPA轴),在正常情况下,负反馈回路能抑制CRF的进一步合成和释放,而在HPA轴调节发生异常时则会引起负反馈功能障碍,过度增加的血浆糖皮质激素合成释放,最后会进入中枢造成神经元的损伤。然而目前的研究发现,CRF除了通过HPA轴引起神经元损伤外,还可通过与中枢CRF受体作用引起海马神经元损伤。因此探索CRF对海马神经元的损伤作用及可能机制,可为应激损伤中枢神经元的分子机制提供新理论和实验依据。目的：系统研究CRF通过CRFR1受体后信号通路直接导致中枢神经元损伤的分子机制,旨在揭示与慢性应激相关的神经精神疾病的病理生理机制,为最终阐明慢性应激损伤中枢神经元的分子机制提供新理论和实验依据。方法：1、免疫荧光法分析CRF对海马神经元结构的影响：培养原代海马神经元细胞至第五天,CRF (0.02μM,0.2μM,2μM)处理原代培养的大鼠海马神经元,继续培养至第十天。显微镜下观察海马神经元细胞结构的变化,然后用丝裂原活化蛋白-2(Mitogen Activated Protein, MAP2)标记海马神经元树突,免疫荧光法观察海马神经元树突的变化。用CRFR1特异性拮抗剂(DMP696)处理海马神经元细胞,同样显微镜下观察对照组、CRF处理组和CRF+特异性拮抗剂(DMP696)海马神经元细胞结构的变化,然后用MAP2标记海马神经元树突,免疫荧光法观察海马神经元树突的变化。2、磺酰罗丹明B (sulforhodamine B, SRB)法检测CRF对海马神经元细胞活力的影响：培养原代海马神经元细胞至第五天,加入不同浓度的CRF处理海马神经元细胞,实验分为：空白组(无细胞),对照组(不加药物组),CRF (0.02μM,0.2μM,2μM)处理组。培养至第十天SRB法测细胞活力。3、Western Blot分析与神经元生长密切相关的关键分子蛋白水平的变化：培养原代海马神经元细胞至第五天,CRF (0.02μM,0.2μM,2μM)处理原代培养的大鼠海马神经元,继续培养至第十天。Western Blot分析cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element bindingprotein, CREB),微管相关蛋白(microtubule asso-ciated proteins, Tau)磷酸化水平的变化,及MAP2,突触后密度蛋白-95(Postsynaptic density-95, PSD95)蛋白水平的变化,观察CRF是否对海马神经元细胞的以上几种蛋白的水平产生影响。然后在原代培养的大鼠海马神经元上,分别利用蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)、磷脂肌醇(protein kinase C, PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、1,4,5-三磷酸肌醇(Inositol1,4,5-triphophate, IP3)、磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)的特异性抑制剂H89. Calphostisc、PD98059、2-APB、U-73122与CRF共孵育,Western Blot检测CREB, Tau磷酸化水平的变化,及MAP2, PSD95蛋白水平的变化,分析参与这种变化的信号通路。4、RT-PCR法分析与神经元生长密切相关的关键分子mRNA表达水平的变化：培养原代海马神经元细胞至第五天,用CRF及DMP696处理原代培养的大鼠海马神经元,继续培养至第十天。RT-PCR法检测CREB、Tau、MAP2、PSD95mRNA表达的变化。分析以上几种分子的mRNA变化情况。5、环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate, cAMP)释放试验检测海马神经元细胞cAMP含量的变化：培养原代海马神经元细胞至第十天,cAMP释放试验检测CRF刺激海马神经元细胞释放cAMP的含量变化,并检测DMP696对CRF刺激海马神经元细胞释放cAMP含量的影响。分析cAMP是否参与了CRFR1介导的海马神经元的损伤作用。结果：1、2μM CRF可引起海马神经元树突密度减少,用特异性拮抗剂(DMP696)处理细胞,CRF可引起海马神经元树突密度减少的作用明显被拮抗。2、CRF对海马神经元细胞活力产生抑制,CRF (0.2μM,2μM)处理组细胞活力依次为71.6士3.1%,72.6±3.5%(n=3,***P<0.001与对照组相比)。3、2μMCRF可下调海马神经元细胞MAP2,P-CREB蛋白水平,上调PSD95, P-Tau蛋白水平；CRFR1特异性拮抗剂(DMP696)可拮抗CRF引起的MAP2, P-CREB蛋白水平下调及PSD95, P-Tau蛋白水平上调；PKA特异性抑制剂H89可拮抗CRF引起的MAP2蛋白水平下调及P-Tau蛋白水平上调。4、海马神经元细胞中PSD95, MAP2的mRNA表达水平的变化与蛋白水平的变化一致,Tau与CREB的mRNA表达水平无明显变化。5、cAMP释放试验表明CRF可浓度依赖性的调节海马神经元细胞cAMP含量的变化(EC50=(3.157±0.133)×10-9M, n=3),并且特异性拮抗剂DMP696可减少2μMCRF引起的海马神经元cAMP释放水平(n=3,***P<0.001,‘P<0.05,与-5组相比)。结论：CRF通过与CRFR1作用引起海马神经元结构损伤,其作用与下调MAP2及P-CREB的蛋白水平,上调PSD95, P-Tau蛋白水平相关。CRF促进cAMP的释放,提示CRFR1偶联的G蛋白为Gs。CRF引起的MAP2蛋白水平下调及P-Tau蛋白水平上调可能是PKA通路参与调节的。