【摘 要】
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白细胞介素10（Interleukin-10,IL-10）是免疫系统的一个重要调节因子,主要由Th2细胞产生,是细胞因子中唯一具有免疫下调作用的细胞因子,且具有广泛的生物学活性,包括免疫抑制、抗炎症及免疫调节特性,主要功能是限制和终止炎症反应,调节多种免疫细胞的分化和增殖,清除感染颗粒。研究表明,人白细胞介素10（hIL-10）在炎症、恶变、自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥反应等多种疾病的发生和发展
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白细胞介素10（Interleukin-10,IL-10）是免疫系统的一个重要调节因子,主要由Th2细胞产生,是细胞因子中唯一具有免疫下调作用的细胞因子,且具有广泛的生物学活性,包括免疫抑制、抗炎症及免疫调节特性,主要功能是限制和终止炎症反应,调节多种免疫细胞的分化和增殖,清除感染颗粒。研究表明,人白细胞介素10（hIL-10）在炎症、恶变、自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥反应等多种疾病的发生和发展过程中都有重要的免疫调节作用。hIL-10在临床上广泛应用于急性肺损伤、炎症性肠病、实验性脓毒败血症休克、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、丙型肝炎、再灌注损伤等疾病的治疗。动物乳腺反应器是1989年美国人Gordon发明的,该技术利用转基因技术实现外源基因在动物乳腺特异性表达,具有产出蛋白生物活性高、纯化简单、成本低、对环境没有任何污染等优点,广泛应用于药用蛋白的生产。为了构建hIL-10乳腺特异表达载体,研发能够稳定表达hIL-10的乳腺生物反应器,本研究以牛、人全基因组DNA为模板,通过PCR克隆了牛β-酪蛋白（bβ-CN）基因5′调控区序列和hIL-10基因,将bβ-CN 5′调控区序列和hIL-10连接入pcDNA3.1（+）真核表达载体,构建出携带hIL-10的重组质粒pcDNA3.1（+）-bβCN-hIL-10。利用显微注射法将Bst1107 I单酶切线性化pcDNA3.1（+）-bβCN-hIL-10质粒导入受精卵雄原核,并将正常胚胎移入受体雌鼠子宫。试验结果如下:1.hIL-10基因的克隆参照Genbank中注册的X78437 hIL-10基因序列设计引物,运用PCR技术,以人全基因组DNA为模板,扩增片段长1993bp。将扩增产物与pUM-T连接,构建重组质粒pUM-hIL-10,经PCR、酶切及序列测定表明,扩增序列成功插入pUM-T,且该序列与X78437同源性达到99.19%,成功克隆出hIL-10基因。2.牛β-CN基因5′调控序列的克隆参照Genbank中注册的X14711 bβ-CN序列设计引物,运用PCR技术,以荷斯坦奶牛全基因组DNA为模板,扩增长3165bp的奶牛β-酪蛋白5′调控序列。将扩增产物与pUM-T连接,构建重组质粒pUM-bβ-CN,经PCR、酶切及序列测定表明,扩增序列成功插入pUM-T,且该序列与X14711的同源性达98.29%,成功克隆bβ-CN 5′调控区序列。3.重组质粒pcDNA3.1（+）-bβCN-hIL-10的构建将pUM-hIL-10用BamH I和Not I双酶切,回收小片段,定向克隆至经同样酶切处理的质粒pcDNA3.1（+）,构建表达载体pcDNA3.1（+）-hIL-10;将pUM-bβ-CN用Kpn I和BamH I双酶切,回收大片段,定向克隆至经同样酶切处理的质粒pcDNA3.1（+）-hIL-10,构建出pcDNA3.1（+）-bβCN-hIL-10质粒。经PCR和双酶切鉴定,结果表明,hIL-10、bβ-CN 5′调控序列基因插入到pcDNA3.1（+）中。4.显微注射及胚胎移植选择13只雌鼠进行超数排卵,合笼后次日早上检查阴栓,将6只有阴栓雌鼠进行解剖并采集受精卵,获得发育正常、原核清晰的受精卵170枚;通过显微注射法将纯化的pcDNA3.1（+）-bβCN-hIL-10线性化片段注射入受精卵雄原核中,经体外培养后,有113枚胚胎正常发育至桑葚胚或囊胚,发育率达66.5%,证明本试验构建的真核表达载体对胚胎发育的影响较小,具有一定的生物安全性。
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