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盆底局部肌组织再生能力障碍是女性压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)发生的重要原因。除了传统的手术和药物治疗以外,干细胞移植是目前行之有效且具有广阔前景的一种SUI治疗方法。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是组织工程(Tissue Engineering)重要的种子细胞。BMSCs移植到SUI患者的尿道周围组织后,可通过替代、修复受损的尿道括约肌,增强尿道括约肌张力,改善尿控功能,有望从根本上治疗SUI。干细胞移植入体内后向靶组织和器官的募集情况,是整个干细胞治疗成功与否的基础,直接关系到其治疗效果,因而一直是组织工程领域备受关注的问题。目前干细胞移植普遍存在着归巢率低、疗效欠佳的现状,如何人为地有效引导干细胞向靶组织募集,提高干细胞的归巢率,是当下急需解决的问题之一。基质细胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)及其受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4轴在干细胞归巢的调控中发挥着重要作用。CXCR4广泛表达于多种组织细胞,在BMSCs亦有表达。SDF-1可诱导CXCR4+细胞从低浓度向高浓度趋化迁移。基于细胞的这种趋化特性,我们可以通过调节SDF-1/CXCR4轴的表达,间接对这种趋化作用的强弱进行人为调控。已有研究证实雌激素可以上调SDF-1/CXCR4轴的表达,提示雌激素干预可作为调节SDF-1/CXCR4表达的手段,进而调控BMSCs的趋化迁移。本研究以3周龄的雌性SD大鼠为材料,全骨髓+贴壁法分离并培养BMSCs,以不同浓度的17p-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)分别干预BMSCs,检测其CXCR4基因和蛋白的表达变化,从中选择可诱导BMSCs获得最高表达CXCR4的E2浓度,观察该浓度E2干预的BMSCs趋化能力的变化。主要实验方法与结果如下：一、大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养与鉴定1. BMSCs的分离、培养与鉴定无菌条件下取3周龄雌性SD大鼠双侧胫骨、腓骨,暴露骨髓腔,含10%FBS的DMEM-F12充分冲洗骨髓腔,收集全部冲洗液,离心后留取沉淀加入10%FBS的DMEM-F12培养液,于37℃,含5%CO2的培养箱中培养。取第三代细胞经抗体孵育后上流式细胞仪检测细胞表面CD44.CD45.CD31.CD29和CD166的表达情况。结果：分离出的细胞传至第三代时形态均一,呈长梭形,其细胞表面CD44、CD29高表达,CD45、CD31和CD166低表达,符合BMSCs的免疫表型特点。二、BMSCs CXCR4表达的测定1.PCR法检测BMSCs CXCR4表达以106/孔的细胞量将第2代BMSCs接种至6孔细胞培养板,于10%FBS的DMEM-F12培养液中培养至细胞铺满60%～70%时进行雌激素干预实验。本研究设置6个17β-E2干预浓度,即10-10、10-9、10-8、10-7、5×10-7和10-6mol/L。2个实验组分别为E2干预组和E2拮抗组。E2拮抗组的细胞预先用10-8mo1/L雌激素受体拮抗剂ICI182780封闭1h。每组设置13个孔,分别编号为1-13号,分别以1号孔为对照。E2干预组2-7号孔和8-13号孔分别依次加入不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7、5×10-7、10-6mol/L)的17β-E2进行干预,E2拮抗组每孔在E2干预基础上再向每孔以10-6mol/LICI182780拮抗雌激素受体(ER)。干预组和拮抗组的2-7号和8-13号孔E2干预时间分别为24h和48h。干预完成后收集BMSCs,PCR法检测各孔细胞CXCR4mRNA表达情况。结果：干预24h时,CXCR4mRNA表达在10-7mol/L17β-E2诱导时表达最高；干预48h时,CXCR4mRNA在5×10-7mol/L17β-E2诱导时表达最高.10-8mol/L的ICI182780能够明显抑制17β-E2对BMSCs CXCR4mRNA表达的调高作用。2.Western blot法检测BMSCs CXCR4表达按上述方法用各浓度17β-E2和ICI182780处理干预组和拮抗组BMSCs,收集细胞用Western blot法检测各浓度17β-E2诱导后CXCR4蛋白的表达。结果：干预24h和48h时,CXCR4蛋白表达均在5×10-7mol/L17p-E2诱导时表达最高。10-8mol/L的ICI182780能够明显抑制17β-E2对BMSCs蛋白表达的调高作用。三、17β-E2对BMSCs定向迁移影响的检测1.17β-E2对BMSCs向SDF-1定向迁移的影响实验在24孔细胞培养板上进行,设置对照组和E2干预组。对照组BMSCs未经E2干预,E2干预组BMSCs预先在含10-7mol/L17.β雌二醇的10%FBS培养基中培养24h。每组分别设置4孔,标记为1-4号。两组孔内均依次加入含0、100.200.300ng/mLSDF-1的无血清培养基500μL,利用悬挂式细胞培养小室transwell(8μm)观察细胞的迁移情况。transwell内按2×104/孔接种细胞。培养箱内培养24h,进行洗涤、固定和伊红染色。显微镜下随机取5个视野(光镜×100倍)计数染色细胞,SPSS13.0对迁移细胞数进行统计分析。结果：对照组和E2干预组BMSCs均在SDF-1浓度为200ng/ml时细胞迁移数达到最大,且在相同SDF-1浓度下,E2干预组细胞迁移数要显著大于对照组。2.CXCR4阻断实验设置对照组和E2干预组,标记为5号。按上述方法处理2组细胞,分别取对照组和E2干预组细胞各200μl,加入CXCR4受体阻断剂AMD3100100ng/mL孵育30min,依照上述步骤行微孔隔离穿越实验。结果：在对照组,CXCR4阻断后的BMSCs细胞迁移数与对照组1号孔无明显差异；在E2干预组,CXCR4阻断后细胞迁移数与同组1号孔有差异。结论：本研究成功分离、培养了SD大鼠骨髓间充质干细胞,并获得了可诱导BMSCs高表达CXCR4的17β-E2最适浓度和干预时间,以及BMSCs定向迁移的最适SDF-1浓度。研究表明,17β-E2可以通过上调BMSCs CXCR4的表达,促进BMSCs向SDF-1定向迁移,17β-E2的这种上调作用可以被雌激素受体阻断剂ICI182780所阻断。