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七鳃鳗是迄今为止最为原始的无颌类脊椎动物,是名副其实的“活化石”。寒武纪时期的甲胄鱼类与七鳃鳗有共同的祖先,七鳃鳗无论是在脊椎动物进化研究上还是免疫系统的研究中都被作为适应性进化和起源的新型模式生物。海七鳃鳗(Petromyzon marinus)作为无颌类脊椎动物的典型代表之一,成为海洋生物进化的模式生物。日本七鳃鳗(Lampetra japonica)分布在我国东北部鸭绿江流域,是与海七鳃鳗亲缘关系极为接近的主要七鳃鳗物种。目前有关七鳃鳗的基础研究工作,主要集中在已经完成全基因组测序的日本七鳃鳗和海七鳃鳗。在哺乳动物中,趋化因子配体12(Chemokine(C-X-C motif)ligand 12,CXCL12),又称基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)以及前B细胞刺激因子(pre-B cell growth-stimulating factor),与其受体CXCR4(CXC chemokine receptor 4)分别属于CXC类趋化因子和CXCR类G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR)超家族。最近功能研究表明,CXCL12/CXCR4轴在机体的免疫、炎症、胚胎发育、器官发生、肿瘤、HIV疾病、WHIM综合征(疣、低丙种球蛋白血症、细菌感染以及无效生成性慢性粒细胞缺乏的四联症,warts-hypogammaglobulinemia-infections-myelokathexis syndrome,WHIM)等多种生物学过程中发挥着重要的作用,已成为当今生物学研究的热点之一。然而在七鳃鳗中CXCL12与CXCR4是否为配体-受体关系不得而知,他们在七鳃鳗免疫学中的相互作用关系和机制更是鲜有报道。虽然日本七鳃鳗全基因组测序已经完成,但是与最新海七鳃鳗全基因组测序组装的完整性比较而言,仍然有许多基因没有明确的注释。本研究首次以已经测序组装较完善的海七鳃鳗全基因组数据库为依据,结合日本七鳃鳗的基因组数据库信息,通过生物信息学方法对日本七鳃鳗免疫相关分子CXCL12以及其可能的受体CXCR4基因进行了信息挖掘,发现了与其他物种具有同源性的日本七鳃鳗CXCL12和其可能的受体CXCR4基因。由此将它们作为目标基因进行了进一步的研究。首先,设计合成CXCL12序列引物,从日本七鳃鳗鼻组织来源的cDNA中扩增并克隆日本七鳃鳗CXCL12基因的编码区,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术获得日本七鳃鳗CXCL12序列,构建pMD19-T-CXCL12重组质粒后测序,证实其序列的正确性,并结合生物信息学方法对日本七鳃鳗CXCL12序列进行深入分析。主要包括对其编码蛋白的氨基酸序列的开放阅读框(open reading frame,ORF)、基本理化性质、亲/疏水性、跨膜结构域、功能域、保守结构、蛋白质的二级结构等进行相应的预测和分析,同时通过N-J算法对CXCL12蛋白进行系统发育分析。研究结果发现克隆的日本七鳃鳗CXCL12编码区序列长为267 bp,共编码88个氨基酸。相对分子质量为10.10 kD,理论等电点为10.60,pH=7时的净电荷为11.80。CXCL12氨基酸序列中,在保守的C31和C33之间含有一个脯氨酸残基,并且含有一段由22个氨基酸组成的信号肽,以及4个保守的半胱氨酸残基,属于典型的CXC型的趋化因子。该研究为进一步探讨七鳃鳗CXCL12基因的系统进化及在免疫学中的功能提供了理论依据。随后,设计合成CXCR4序列引物,从日本七鳃鳗鼻组织来源的cDNA中扩增并克隆日本七鳃鳗CXCR4基因的编码区,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术获得日本七鳃鳗CXCR4序列,构建Rho-pCMV-CXCR4和Lucy-Rho-pCMV-CXCR4真核表达载体后测序,证实其序列的正确性,并结合生物信息学方法对日本七鳃鳗CXCR4序列进行深入分析。同时将重组质粒转染至HEK293T细胞中,24h后经间接免疫荧光化学(immunocytochemistry,ICC)检测CXCR4的表达情况。主要包括对其编码蛋白的氨基酸序列的开放阅读框(open reading frame,ORF)、基本理化性质、亲/疏水性、跨膜结构域、功能域和蛋白质的二级、三级结构等进行相应的预测和分析,同时通过N-J算法对CXCR4蛋白进行系统发育分析。研究结果发现克隆得到的日本七鳃鳗CXCR4编码区序列长为1113 bp,该基因共编码了370个氨基酸,分子量为40.90 kD,等电点为8.28,pH=7时的净电荷为4.30,日本七鳃鳗的CXCR4蛋白含有7个跨膜结构域,属于GPCR家族,推测日本七鳃鳗的CXCR4蛋白功能可能与其他已知哺乳动物的CXCR4蛋白功能相一致。同时对日本七鳃鳗CXCR4蛋白二级结构和三级结构的预测发现,其二级结构中,α-螺旋含量最高,说明其具有多次跨膜结构,符合跨膜蛋白的特征;无规卷曲约占30%,表明该蛋白构象具有多样性的特征,与钙离子激活蛋白的激活和关闭时的构象变化相符;三级结构α-螺旋区域构成中空的螺旋筒状,为离子的通过提供了基础,从另外一个方面辅证了日本七鳃鳗CXCR4蛋白在细胞中可能作为离子通道发挥作用。最后,通过免疫荧光化学的方法验证了日本七鳃鳗CXCR4能够在HEK293T细胞上很好地表达。综上所述,本文克隆得到日本七鳃鳗的趋化因子CXCL12及其可能的受体CXCR4,并对他们进行了分子结构及生物信息学分析,取得的一系列结果为后续进一步验证日本七鳃鳗CXCL12与CXCR4互为配体-受体的关系奠定了重要基础,同时对日本七鳃鳗CXCL12和CXCR4蛋白的系统进化和功能研究、筛选新型药物靶点以及相关疾病的治疗提供了基础信息。