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前言： 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁着妇女健康。尽管目前应用的抗肿瘤综合治疗已经很大提高了临床疗效，但这些治疗仍不能有效的减少乳腺癌的复发和转移，及控制晚期乳腺癌的进展，而复发和转移是乳腺癌治疗失败和患者死亡的主要原因。近年来随着肿瘤干细胞的研究进展，肿瘤干细胞被认为是肿瘤复发、转移的根源。乳腺癌干细胞作为异质性的全体肿瘤细胞的产生源泉，在恶性肿瘤的发生发展，侵袭转移中起着极其重要的作用。从肿瘤干细胞的角度探讨乳腺癌发生发展和耐药的机制和寻找治疗策略的改进有着事半功倍的效果。 材料与方法： 一、病例组织标本 276乳腺癌标本来源于2003年1月-2006年12月年间就诊于中国医科大学第一附属医院肿瘤外科和辽宁省肿瘤医院并行乳腺癌根治手术治疗的乳腺癌患者。均为女性患者，平均年龄45岁（25～76岁）。我们取得了每一位患者的书面知情同意，实验通过了中国医科大学伦理委员会的批准。标本满足条件如下: (a)患者经过有效手术治疗; (b)切除的乳腺癌组织经过病理学检测; (c)手术后有至少15个淋巴结送病理确认; (d)有完整的临床病理资料，不符合上述条件的乳腺癌患者排除在外。 我们取得了每一位患者的书面知情同意，实验通过了中国医科大学伦理委员会的批准。 二、试剂 1)鼠源性单克隆抗人Oct4，Nanog抗体购自美国Abicom公司，正常山羊血清封闭液购自武汉博士德公司; 2）Ultra Sensitive TM S-P超敏浓缩试剂盒:Kit-0305，购自福州迈新生物技术开发有限公司;LI-9032/9033 DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。鼠源性单克隆抗人Nestin抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，Nanog抗体购自美国Abicom公司，正常山羊血清封闭液购自武汉博士德公司; 3）Ultra Sensitive TM S-P超敏浓缩试剂盒:Kit-0305，购自福州迈新生物技术开发有限公司;LI-9032/9033 DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 三、方法 组织中Nestin，Oct-4与Nanog蛋白的表达检测应用免疫组织化学(IHC)方法;CD44+/CD24-CSC分选采用免疫荧光抗体标记后流式细胞仪二次分选，CSC培养采用低粘附培养板下的无血清悬浮培养;细胞转染采用Lipofectamine TM 2000脂质体转染试剂进行;TGF-β处理细胞诱导细胞上皮间质化(EMT);蛋白和mRNA表达检测分别采用Western Blot和RT-PCR，细胞成瘤能力检测采用C57BL/6SCID鼠成瘤试验，细胞侵袭力检测采用Trans Well的方法检测。 四、统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包处理数据。Nestin，Oct-4与Nanog的表达与临床病例参数的相关性采用Pearson卡方检验或Fishers确切概率法进行;总体生存期(Overall survival,OS)及无病生存期(desease free survival，DFS)采用Kaplan-Meier方法计算，生存期组间比较采用log-rank检验;Cox regression模型单变量及多变量分析用于检验影响生存主要独立危险因素;P＜0.05定义为有统计学意义 结果： 126例乳腺癌标本中Oct-4与Nanog的阳性表达率分别为41.27％(52/126)，36.51％(47/126)，其中26(20％)例患者Oct-4与Nanog表达均为阳性。与阴性表达的患者相比，Oct-4(P=0.01)与Nanog(P=0.01)阳性表达的患者OS均较差，而且Oct-4与Nanog共表达的患者预后最差(P=0.001 Vs Oct-4-/Nanog-)。COX回归模型分析发现Oct-4是影响乳腺癌预后独立的独立危险因素(P=0.003)。我们进一步检测了Oct-4和Nanog共表达在维持乳腺癌干细胞EMT特性中的作用。我们发现沉默Oct-4和Nanog后，CSC中N-cadherim，Vimentin，Slug，and Snail的表达显著降低，E-cadherin和CK-18的表达显著上调，相反，Oct-4和Nanog的过表达显著的增加了N-cadherin，Vimentin，Slug，and Snail的表达，降低了E-cadherin和CK-18的表达。以上的这些改变在转染后72小时更加明显。流式细胞术结果表明，在TGF-β处理后，N-cadherinbright E-cadherin-表型的EMT-样CSC的比例明显升高。我们进一步分离了TGF-β处理后N-cadherinbright E-cadherin-表型的EMT-样和N-cadherindim E-cadherinbright非EMT样CSC，比较了Oct-4和Nanog的mRNA表达水平。结果表明Oct-4和Nanog mRNA水平在EMT-样CSC细胞中较非-EMTCSC显著升高(p＜0.05 for both)。我们进一步探测Oct-4 and Nanog的表达对于TGF-β诱导的CSC细胞EMT的重要性。CSC细胞同时沉默或同时过表达Oct-4和Naong，在转染siRNA或过表达质粒后24小时，细胞用TGF-β处理72小时，检测N-cadherin，E-cadherin，CK-18，Vimentin，Slug，和Snail等的mRNA和蛋白表达水平。乳腺癌CSC中，Oct-4和Nanog同时沉默后，与未受刺激的细胞相比，TGF-β刺激导致细胞N-cadherin，Snail的表达上调，E-cadherin和CK18表达水平下调，表明在Oct-4与Nanog共沉默的CSC中TGF-β仍可以诱导细胞EMT过程;有趣的是在Oct-4与Nanog共同高表达的CSC中，与未刺激的CSC细胞相比，TGF-β刺激后N-cadherin，Vimentin，Slug,和Snail的表到水平并未改变，但是E-cadherin和CK-18的表达水平轻微升高;这些结果表明乳腺癌CSC细胞中Oct-4和Nanog的表达对TGF-β诱导的EMT过程具有一定影响。表明Oct-4和Nanog高表达后细胞的侵袭力增加。我们采用免疫组化的方法检测了150例三阴性乳腺癌患者肿瘤组织中Nestin的表达，结果表明癌组织中有41例(27.33％)患者癌细胞胞浆内可检测到Nestin的表达;进一步研究表明三阴性乳腺癌患者中，Nestin阳性表达的患者生存期较Nestin阴性的患者明显缩短。我们探讨了Nestin对乳腺癌干细胞致瘤性的影响，结果表明Nestin+的乳腺癌干细胞致瘤性较Nestin-的乳腺癌干细胞强。较强的肿瘤形成能力往往与细胞的增殖力有关，于是我们进一步采用流式细胞术检测了Nestin沉默后乳腺癌干细胞周期和凋亡的变化，与对照组相比Nestin沉默的乳腺癌干细胞G2/M期的细胞比例显著增加，伴有死亡细胞比例的增加;同时Nestin沉默后凋亡细胞的比率较对照组明显增加(43.53±4.78％vs.16.24±3.22％，p＜0.01)。因此，Nestin沉默后会诱导细胞周期阻滞于G2/M，及促进细胞凋亡，这些结果迸一步证明Nestin促进乳腺癌干细胞的增殖及存活。为阐明Nestin影响乳腺癌干细胞侵袭迁移的机制我们采用Western blot的方法检测了Nestin沉默后乳腺癌干细胞中EMT相关基因及调控基因的表达，结果表明，与对照组相比Nestin沉默后N-cadherin，Vimentin和α-SMA表达显著下调，E-cadherin明显增加;并且MMP2，MMP9及VEGF的表达也明显下降;这些结果表明Nestin沉默后抑制了乳腺癌干细胞自发EMT过程，其机制可能与迷乱性的激活Wnt/β-catenin通路有关。最后我们通过western blot的方法检测了Nestin沉默后是如何影响GSK-3β的磷酸化水平，Nestin可能通过间接促进乳腺癌干细胞中GSK-3β的磷酸化进而提高Wnt/β-catenin通路活性。 结论： Oct-4的表达与乳腺癌起源和生物学行为的关系已成为肿瘤研究过程中亟待解决的问题。通过本研究提示Oct-4在乳腺癌中高表达，不但与乳腺癌的生物学行为密切相关，而且是乳腺癌的独立预后因素。同时，TGF-β/Sma3与Oct-4/Nanog在促进乳腺癌侵袭和转移方面具有协同作用。 Nestin在一些三阴性乳腺癌组织中呈阳性表达并与患者的不良预后有关，而且，我们发现Nestin阳性的乳腺癌干细胞具有更强的体外克隆增殖能力及对裸鼠较强的致瘤性，敲除Nestin表达后抑制乳腺癌干细胞的增殖和侵袭力，诱导了细胞的凋亡;敲除Nestin后乳腺癌干细胞自发EMT过程受到抑制，Wnt/β-catenin通路活性也被抑制，其机制可能是敲除Nestin后抑制了GSK-3β的磷酸化从而抑制了Wnt/β-catenin通路活性。