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目的：
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种较为常见的神经退行性疾病，存在记忆下降、认知障碍等临床症状，主要的病理改变是β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)在细胞外过度沉积和tau蛋白在细胞内过度磷酸化形成神经纤维缠结。
目前越来越多的研究表明，神经炎症反应在AD中起着重要作用，参与AD发生和发展的各个阶段。体外细胞实验及动物实验研究显示Aβ的沉积可以引起脑内主要的固有免疫细胞小胶质细胞(microglial，MG)和星形胶质细胞(astrocyteAC)在激活状态上发生改变，以及炎性细胞因子表达发生变化。同时动物实验研究显示AD脑内慢性炎症反应能够加重细胞外Aβ沉积及神经细胞凋亡。
淫羊藿昔(irrica，ICA)是来自于中药淫羊藿的活性成分，是一种天然黄酮类物质，具有多种作用，如抗肿瘤、抗炎、抗凋亡等。在AD模型小鼠中，ICA能够抑制Aβ片段的产生，并能保护突触不受损害。我们前期研究证实ICA治疗可以调节APP/PSI小鼠外周免疫反应，且具有改善焦虑刺激模型小鼠的学习记忆和空间认知的作用。
基于前期研究结果，本文主要分析在APP/PSI小鼠中，长期ICA治疗可以对Aβ生成、学习记忆能力、神经元凋亡和中枢炎症反应产生怎样的影响，并探讨其中的作用机制。
方法：
1.主要试剂
淫羊藿苷，购于北京索莱宝科技有限公司
2.实验动物
转基因突变小鼠C57βL/6J-TgN(APP/PSI)（12只，雄性，4月龄），野生型小鼠C57βL/6（6只，雄性，4月龄），购自北京华阜康生物科技公司实验动物研究所。
3.分组处理
实验动物分为三组:野生型组（WT组）、APP/PSI组(Tg组)、APP/PSI+ICA组（Tg+ICA组），每组6只。对Tg+ICA组小鼠进行ICA灌胃8个月，ICA剂量为60mg/kg/d，剩余小鼠给予同体积的蒸馏水。
4.实验方法
4.1行为学实验
将水池分为四个象限，让各组小鼠分别从四个象限入水，寻找水池中的平台，每天训练4次，连续5天。记录每只小鼠寻找到平台的时间，如果寻找平台的时间超过了60秒，则时间记录为60秒。分别计算每组小鼠寻找平台的平均时间，得到的结果即为逃避潜伏期。在第6天，将水池中的平台拿走，再让每只小鼠从同一位置入水，记录60秒内每只小鼠穿越平台的次数，各组取平均数;以及记录60秒内每只小鼠在目标象限内停留的时间，各组取平均数。
4.2免疫组织化学染色法
处死小鼠，断头取脑。将右半边脑组织包埋，用切片机进行冠状位切片。拷片后把切片放在柠檬酸钠缓冲液中，放入高压锅进行抗原修复。抗原修复后，切片依然放置于柠檬酸钠缓冲液中，并一同冷却至室温。将切片取出，滴加H202于室温下孵育15min。用PβS洗3遍后，滴加一抗rabbit anti-Aβ(浓度1:1000)，rabbit anti-GFAP(浓度1:1000)，goat anti-Iba-1（浓度1:1000），rabbitanti-TNF-α（浓度1:1000），rabbit anti-IL-1β（浓度1:1000），4°过夜孵育。PβS洗去一抗，依次滴上试剂2反应增强液15min，试剂3辣根过氧化物酶15min。用树胶封片后，在奥林巴斯显微镜下进行观察拍照。统计海马区域的Aβ染色阳性区域(area)和染色总光密度(intergrated opticaldensity，IOD)值(200x);统计CAI区Iba-1、GFAP以及促炎性因子11-1β、TNF-α染色阳性区域个数(400x)。
4.3Western blotting法
从液氮罐中取出小鼠脑组织进行称重，并计算应该加入的裂解液的体积。将加入裂解液的脑组织放在冰上裂解Γh，置于4°离心机12000rpm/min离心30min，βCA试剂盒测定蛋白浓度。将各组蛋白进行浓度配平后，取同体积的蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为恒压lOOv(2h)，转膜条件为恒流200mA(1h30min)。将PDVF膜放在孵育袋中，注入一抗rabbit anti-p65(浓度1:1000)，rabbit anti-p-p65（浓度1:1000），rabbit anti-bcl-2(浓度1:1000)，rabbit anti-bax(浓度1:1000)，rabbit anti-c-caspase3(浓度1:500)，rabbit anti-caspasel(浓度1:1000)，rabbit anti-nlrp3(浓度1:1000)，4℃过夜孵育。回收一抗并用TβST洗三遍后加入二抗，放在室温下的摇床上孵育45min。
5.统计分析
免疫组化和Western blot的图像分析均用Image Pro Plus6.O软件。统计结果采用SPSS22.0软件分析。结果用x±s表示，多组间数据应用单因素方差分析，组间两两比较应用Tukeys多重比较分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.长期ICA治疗可改善APP/PSI小鼠的学习记忆和空间认知能力
WT组、Tg组、Tg+ICA组小鼠第4天的逃避潜伏期（P=4.964，P=0.017）、第5天的逃避潜伏期（F=9.373，P=O.001）、平台穿越次数（F=7.162.P=0.004）以及在目标象限停留时间（F=9.313，P=0.001）的差异均有统计学意义。如图1所示，与WT组相比，Tg组小鼠的逃避潜伏期明显增加，平台穿越次数以及在目标象限停留时间减少，差异有统计学意义（P均<0.05）。与Tg组相比，Tg+ICA组小鼠的逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间增加，差异有统计学意义(P均<0.05)。
2.长期ICA治疗可减少APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积
WT组、Tg组、Tg+ICA组小鼠的Af3area（F=153.300，P<0.001）以及Aβ染色阳性IOD值（F=87.180，P<0.001）的差异均有统计学意义。如图2所示，与WT组相比，Tg组小鼠Aβ的数量明显多于WT组，且Aβarea以及AβIOD值均增加，差异具有统计学意义(P均<0.05)。与Tg组相比，Tg+ICA组小鼠Aβ的数量有所减少，Aβarea以及Aβ染色IOD值均减少，差异具有统计学意义（尸均<0.05）。
3.长期ICA治疗能够调节脑内胶质细胞活化状态
胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)和钙结合配体分子-1（calcium-binding adaptor molecule-1，Iba-1）分别是AC和MG特有的表面标志物。WT组、Tg组和Tg+ICA组小鼠海马CAI区及周边区域的Iba-1（F=32.110，P<0.001）和GFAP（F370.200，P<0.001）的染色阳性区域个数的差异均有统计学差异。如图3所示，与WT组相比，Tg组小鼠胶质细胞有明显的形态改变，例如胞体增大，突起增多，且海马CAI区及周边的GFAP和Iba-1的染色阳性区域个数增加，差异具有统计学意义（P均<0.05）。与Tg组相比，Tg+ICA组小鼠海马CAI区及周边的Iba-1和GFAP的染色阳性区域个数减少，差异具有统计学意义（P均<0.05）。
4.长期ICA治疗能够抑制APP/PSI小鼠促炎性细胞因子的产生
AD中胶质细胞激活会导致促炎性细胞因子表达增加。WT组、Tg组和Tg+ICA组小鼠的IL-1β（F=190.100，P<0.001）和TNF-α（F=26.260，P<0.001）染色阳性区域个数的差异具有统计学意义。如图4所示，与WT组相比，Tg组小鼠海马CAI区IL-1β和TNF-α染色阳性区域个数增多，差异有统计学意义（P均<0.05）。与Tg组相比，Tg+ICA组小鼠海马CAI区IL-1β染色阳性区域个数减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论：
1.长期淫羊藿苷治疗可以改善APP/PSI小鼠认知功能
2.长期淫羊藿苷治疗可以减少APP/PSI小鼠海马区Aβ沉积
3.长期淫羊藿苷治疗可以减少APP/PSI小鼠神经元凋亡
4.长期淫羊藿苷治疗可以通过下调p-p65表达，抑制APP/PS1小鼠脑内胶质细胞激活，减少促炎因子生成
5.长期淫羊藿苷治疗可以抑制nlrp3炎性小体信号通路相关蛋白表达。
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种较为常见的神经退行性疾病，存在记忆下降、认知障碍等临床症状，主要的病理改变是β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)在细胞外过度沉积和tau蛋白在细胞内过度磷酸化形成神经纤维缠结。
目前越来越多的研究表明，神经炎症反应在AD中起着重要作用，参与AD发生和发展的各个阶段。体外细胞实验及动物实验研究显示Aβ的沉积可以引起脑内主要的固有免疫细胞小胶质细胞(microglial，MG)和星形胶质细胞(astrocyteAC)在激活状态上发生改变，以及炎性细胞因子表达发生变化。同时动物实验研究显示AD脑内慢性炎症反应能够加重细胞外Aβ沉积及神经细胞凋亡。
淫羊藿昔(irrica，ICA)是来自于中药淫羊藿的活性成分，是一种天然黄酮类物质，具有多种作用，如抗肿瘤、抗炎、抗凋亡等。在AD模型小鼠中，ICA能够抑制Aβ片段的产生，并能保护突触不受损害。我们前期研究证实ICA治疗可以调节APP/PSI小鼠外周免疫反应，且具有改善焦虑刺激模型小鼠的学习记忆和空间认知的作用。
基于前期研究结果，本文主要分析在APP/PSI小鼠中，长期ICA治疗可以对Aβ生成、学习记忆能力、神经元凋亡和中枢炎症反应产生怎样的影响，并探讨其中的作用机制。
方法：
1.主要试剂
淫羊藿苷，购于北京索莱宝科技有限公司
2.实验动物
转基因突变小鼠C57βL/6J-TgN(APP/PSI)（12只，雄性，4月龄），野生型小鼠C57βL/6（6只，雄性，4月龄），购自北京华阜康生物科技公司实验动物研究所。
3.分组处理
实验动物分为三组:野生型组（WT组）、APP/PSI组(Tg组)、APP/PSI+ICA组（Tg+ICA组），每组6只。对Tg+ICA组小鼠进行ICA灌胃8个月，ICA剂量为60mg/kg/d，剩余小鼠给予同体积的蒸馏水。
4.实验方法
4.1行为学实验
将水池分为四个象限，让各组小鼠分别从四个象限入水，寻找水池中的平台，每天训练4次，连续5天。记录每只小鼠寻找到平台的时间，如果寻找平台的时间超过了60秒，则时间记录为60秒。分别计算每组小鼠寻找平台的平均时间，得到的结果即为逃避潜伏期。在第6天，将水池中的平台拿走，再让每只小鼠从同一位置入水，记录60秒内每只小鼠穿越平台的次数，各组取平均数;以及记录60秒内每只小鼠在目标象限内停留的时间，各组取平均数。
4.2免疫组织化学染色法
处死小鼠，断头取脑。将右半边脑组织包埋，用切片机进行冠状位切片。拷片后把切片放在柠檬酸钠缓冲液中，放入高压锅进行抗原修复。抗原修复后，切片依然放置于柠檬酸钠缓冲液中，并一同冷却至室温。将切片取出，滴加H202于室温下孵育15min。用PβS洗3遍后，滴加一抗rabbit anti-Aβ(浓度1:1000)，rabbit anti-GFAP(浓度1:1000)，goat anti-Iba-1（浓度1:1000），rabbitanti-TNF-α（浓度1:1000），rabbit anti-IL-1β（浓度1:1000），4°过夜孵育。PβS洗去一抗，依次滴上试剂2反应增强液15min，试剂3辣根过氧化物酶15min。用树胶封片后，在奥林巴斯显微镜下进行观察拍照。统计海马区域的Aβ染色阳性区域(area)和染色总光密度(intergrated opticaldensity，IOD)值(200x);统计CAI区Iba-1、GFAP以及促炎性因子11-1β、TNF-α染色阳性区域个数(400x)。
4.3Western blotting法
从液氮罐中取出小鼠脑组织进行称重，并计算应该加入的裂解液的体积。将加入裂解液的脑组织放在冰上裂解Γh，置于4°离心机12000rpm/min离心30min，βCA试剂盒测定蛋白浓度。将各组蛋白进行浓度配平后，取同体积的蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为恒压lOOv(2h)，转膜条件为恒流200mA(1h30min)。将PDVF膜放在孵育袋中，注入一抗rabbit anti-p65(浓度1:1000)，rabbit anti-p-p65（浓度1:1000），rabbit anti-bcl-2(浓度1:1000)，rabbit anti-bax(浓度1:1000)，rabbit anti-c-caspase3(浓度1:500)，rabbit anti-caspasel(浓度1:1000)，rabbit anti-nlrp3(浓度1:1000)，4℃过夜孵育。回收一抗并用TβST洗三遍后加入二抗，放在室温下的摇床上孵育45min。
5.统计分析
免疫组化和Western blot的图像分析均用Image Pro Plus6.O软件。统计结果采用SPSS22.0软件分析。结果用x±s表示，多组间数据应用单因素方差分析，组间两两比较应用Tukeys多重比较分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.长期ICA治疗可改善APP/PSI小鼠的学习记忆和空间认知能力
WT组、Tg组、Tg+ICA组小鼠第4天的逃避潜伏期（P=4.964，P=0.017）、第5天的逃避潜伏期（F=9.373，P=O.001）、平台穿越次数（F=7.162.P=0.004）以及在目标象限停留时间（F=9.313，P=0.001）的差异均有统计学意义。如图1所示，与WT组相比，Tg组小鼠的逃避潜伏期明显增加，平台穿越次数以及在目标象限停留时间减少，差异有统计学意义（P均<0.05）。与Tg组相比，Tg+ICA组小鼠的逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间增加，差异有统计学意义(P均<0.05)。
2.长期ICA治疗可减少APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积
WT组、Tg组、Tg+ICA组小鼠的Af3area（F=153.300，P<0.001）以及Aβ染色阳性IOD值（F=87.180，P<0.001）的差异均有统计学意义。如图2所示，与WT组相比，Tg组小鼠Aβ的数量明显多于WT组，且Aβarea以及AβIOD值均增加，差异具有统计学意义(P均<0.05)。与Tg组相比，Tg+ICA组小鼠Aβ的数量有所减少，Aβarea以及Aβ染色IOD值均减少，差异具有统计学意义（尸均<0.05）。
3.长期ICA治疗能够调节脑内胶质细胞活化状态
胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)和钙结合配体分子-1（calcium-binding adaptor molecule-1，Iba-1）分别是AC和MG特有的表面标志物。WT组、Tg组和Tg+ICA组小鼠海马CAI区及周边区域的Iba-1（F=32.110，P<0.001）和GFAP（F370.200，P<0.001）的染色阳性区域个数的差异均有统计学差异。如图3所示，与WT组相比，Tg组小鼠胶质细胞有明显的形态改变，例如胞体增大，突起增多，且海马CAI区及周边的GFAP和Iba-1的染色阳性区域个数增加，差异具有统计学意义（P均<0.05）。与Tg组相比，Tg+ICA组小鼠海马CAI区及周边的Iba-1和GFAP的染色阳性区域个数减少，差异具有统计学意义（P均<0.05）。
4.长期ICA治疗能够抑制APP/PSI小鼠促炎性细胞因子的产生
AD中胶质细胞激活会导致促炎性细胞因子表达增加。WT组、Tg组和Tg+ICA组小鼠的IL-1β（F=190.100，P<0.001）和TNF-α（F=26.260，P<0.001）染色阳性区域个数的差异具有统计学意义。如图4所示，与WT组相比，Tg组小鼠海马CAI区IL-1β和TNF-α染色阳性区域个数增多，差异有统计学意义（P均<0.05）。与Tg组相比，Tg+ICA组小鼠海马CAI区IL-1β染色阳性区域个数减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论：
1.长期淫羊藿苷治疗可以改善APP/PSI小鼠认知功能
2.长期淫羊藿苷治疗可以减少APP/PSI小鼠海马区Aβ沉积
3.长期淫羊藿苷治疗可以减少APP/PSI小鼠神经元凋亡
4.长期淫羊藿苷治疗可以通过下调p-p65表达，抑制APP/PS1小鼠脑内胶质细胞激活，减少促炎因子生成
5.长期淫羊藿苷治疗可以抑制nlrp3炎性小体信号通路相关蛋白表达。