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病毒性心肌炎是小儿心血管内科的常见疾病。临床表现轻重不一,可以起病时无症状,逐渐发展成心力衰竭;也可以起病即为暴发型,很快发展成急性心力衰竭。它也是引起扩张型心肌病的一个主要原因。在国外它已经成为青少年心脏移植的一个主要原因。因此VMC是威胁儿童身体健康的一个重要疾病。关于病毒性心肌炎的治疗,一直是困扰临床医生的难题,除传统的清除氧自由基、改善心肌能量代谢及调节机体免疫等减轻心肌损害等方式外,尚无明确而有效的治疗方法。近年来对细胞因子研究的不断深入,许多专家将治疗心肌炎的目光集中在了应用细胞因子治疗上。目前已应用到临床的细胞因子有重组白介素-2,干扰素等。IL-12是分子量为70kD(P70)的异源二聚体分子,由分子量为40kD(P40)与35kD(P35)的两条糖基链经二硫链连接组成。IL-12的具有增强细胞介导的细胞毒作用;能使致敏T细胞与NK细胞的分化增殖;诱导T细胞和NK细胞生成多种细胞因子:IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、M-CSF、IL-13、IL-8、IL-2等,并通过这些介质发挥作用。诱导生成IFN-γ几乎是IL-12最重要的生理功能之一,而且IL -12在内环境中的许多功能,至少一部分是由IFN-γ介导的。IL-12通过对IFN-γ的早期诱导,抑制早期病毒复制与激活细胞毒性T淋巴细胞,起到抗病毒作用。IL-10是IL-12最主要的抑制剂,它本身由IL-12刺激T细胞诱导生成,通过抑制IL-12的基因转录来阻断IL-12生成。在我们的实验中,我们观察重组IL-12在小鼠病毒性心肌炎中的治疗作用,并通过观察治疗过程中细胞因子的变化,NK细胞功能的变化,穿孔素的表达情况及凋亡情况的变化,进一步探讨重组IL-12对病毒性心肌炎的治疗机制。实验方法实验分组:近交BALB/C雄性小鼠,随机编号分为6组。A组:空白对照组,不给予病毒,给予0.9%生理盐水0.1ml/只腹腔注射;B组:病毒对照组,每只腹腔注射CVB30.2ml,于注射病毒后4小时,注射0.9%生理盐水0.1ml/只;C组:药物对照组,每只腹腔注射CVB30.2ml,于注射病毒后4小时,注射干扰素-γ400IU/只;D组:小剂量治疗组,每只腹腔注射CVB30.2ml,于注射病毒后4小时,注射rmIL-12 1ng/只;E组:中剂量治疗组,每只腹腔注射CVB30.2ml,于注射病毒后4小时,注射rmIL-12 10ng/只;F组:大剂量治疗组,每只腹腔注射CVB30.2ml,于注射病毒后4小时,注射rmIL-12 100ng/只。以上小鼠腹腔注射CVB3共3天,药物治疗连续5天。实验一:各组间死亡率的比较,以上各组小鼠每日观察死亡情况并作记录,连续15天。实验二:分组同上。开始注射病毒的时间定为第0天。于实验第5天,每组分别取4只小鼠,每只小鼠称重。摘眼球取血,析出血清用于做IL-10和IFN-γ检测。采血后颈椎脱臼处死。无菌条件下取心脏,取出心脏后称心脏的重量。用于提取心肌RNA、做心肌病毒滴度检测、心肌病理及凋亡检测。无菌条件下取脾脏用于做NK细胞活性检测。于第10天,第15天,每组分别取4只鼠,每只小鼠称重。摘眼球取血后,颈椎脱臼处死。无菌条件下取心脏,取出心脏后称心脏的重量。浸泡于10%福尔马林液中,做好标记,用于做心脏病理检测。1、应用ELISA法检测接种病毒后5天、10天、15天时IL-10和IFN-γ血清浓度。2、无菌条件下,取小鼠心脏,,研磨,制成组织悬液,分别以原液及10-1~10-6分别加入到长有羊膜细胞的培养板中,每天观察细胞病变情况,进行病毒毒力测定。3、无菌条件下取脾脏,研磨、离心、裂解红细胞,以Yak-1细胞为靶细胞,应用MTT法检测小鼠NK细胞活性。4、小鼠心肌中穿孔素的表达。取新鲜小鼠心脏,乳钵研磨,加Trizol变性液后匀浆,Trizol试剂提取小鼠心脏RNA,应用RT-PCR法检测小鼠心脏穿孔素表达情况。5、小鼠心脏取出后用10%福尔马林固定液固定,石蜡包埋、常规制备石蜡切片,染色,封片,显微镜下观察小鼠心肌细胞凋亡情况。结果判定:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。。6、常规制备石蜡切片,应用HE染色,光学显微镜下见细胞核呈蓝黑色,胞浆呈淡红色。坏死细胞呈均质红染的结构物质,核染色质消失。比较各组间心肌炎症情况。统计学分析:统计学数据表示采用均值±标准差,数据分析采用SAS统计学软件分析系统,组间比较采用方差分析,P<0.05为有统计学意义。实验结果实验一结果:除空白组外,中剂量治疗组死亡率最低,大剂量治疗组死亡率最高。实验二结果:1、各组间细胞因子变化的比较从各组间细胞因子IFN-γ、IL-10的变化及统计学比较中我们可以看出,病毒对照组与中剂量组及大剂量组比较有差别(P<0.05),从数值中我们可以看出,大剂量治疗组的IFN-γ及IL-10的血清水平的值要明显高于中剂量治疗组。且IFN-γ的峰值出现的要早于IL-10。2、各组间病毒毒力比较于接种心脏研磨液后第三天,从培养板上我们可以观察到:空白对照组细胞生长良好。病毒对照组于10-4稀释液中出现细胞病变,表现为细胞聚集成团,破碎。干扰素对照组和低剂量治疗组于10-3出现细胞病变,中剂量组和大剂量组于原液出现病变。3、各组间NK细胞活性的比较不同治疗剂量和治疗后的时间对NK细胞活性均有影响。病毒对照组与中剂量组及大剂量组比较有差别(P<0.05),而与干扰素对照组及小剂量治疗组比较无明显差别(P>0.05)。在接种病毒后5天及10天,NK细胞活性随着给rmIL-12的量的增加而增加,并在第10天达到高峰。4、各组间穿孔素表达情况的检测实验结果表明,空白对照组没有穿孔素的表达,其它各组穿孔素均有表达,表达量以中剂量组和大剂量组表达量较多,小剂量组和干扰素对照组表达少于中剂量组和大剂量组,病毒对照组表达量相对较少。5、治疗前后心肌损伤情况的比较。小鼠心脏重量和体重比值的比较,病毒对照组和小剂量治疗组与其它各组之间均有差异(P<0.05),干扰素组和其它各组间均有差异(P<0.05)。各组间心肌炎症变化的比较(HE染色),以中剂量治疗组心肌炎症浸润最轻,而大剂量组心肌细胞变性坏死最重。6、凋亡情况的比较大剂量治疗组心肌细胞凋亡最重,中剂量治疗组次之,小剂量治疗组和干扰素治疗组及病毒对照组凋亡情况接近,空白对照组未见凋亡。结论1、rmIL-12通过增加NK细胞活性而增加了IFN-γ的释放,从而导致rmIL-12治疗组的病毒滴度下降,说明IFN-γ具有限制CVB病毒复制的作用。2、在IFN-γ血清水平上升后,IL-10的水平也上升,而在IL-10水平上升后IFN-γ血清水平下降。说明IL-10和IL-12是在感染的最初阶段是调节IFN-γ合成的两个重要的结抗剂。3、从各组的病理结果我们可以看出,NK细胞活性的增加和IFN-γ的适量分泌可以限制病毒的复制,减轻心肌的炎症反应,4、适当增加NK细胞的活性可以减轻心肌细胞的损伤,但NK细胞活性过渡增加会加重心肌细胞损伤,小鼠死亡率增加。5、rmIL-12通过增加NK细胞活性而增加了穿孔素的释放。穿孔素表达量随rmIL-12治疗剂量的增加而增加。6、适当增加Th1类细胞因子的活性能减轻心肌细胞损伤,起到保护心肌细胞的作用。