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如何使由于牙周疾病而遭到破坏的牙周支持组织获得完全性再生,一直是国内外学者追求的目标和着力研究的热点课题。从发育生物学的角度,要达到牙周组织结构与功能的完全恢复,以下两个因素至关重要:即恰当的细胞类型、适宜的微环境,二者缺一不可。传统牙周组织工程中局部诱导微环境的建立,主要是通过支架材料或单因子诱导的方式来促进牙周间充质干细胞的分化。由于牙周再生的微环境异常复杂,涉及到上皮-间充质的相互作用以及多种生长因子的参与,单纯依靠支架材料或某几种生长因子等非生理诱导的方式局限性较明显。然而,牙周再生修复与正常牙周发育的相似性提示我们,可以通过复制牙周早期发育的进程从而获得牙周组织的完全再生。根端牙胚组织作为牙根/牙周发育的“器官始基”,理论上能够为牙周间充质干细胞提供类似发育期的微环境。因此,本研究拟建立发育期根端牙胚细胞与牙周膜干细胞/骨髓间充质干细胞的间接共培养体系(条件培养液),利用人工重组的发育期牙根/牙周组织微环境,促进牙周膜干细胞/骨髓间充质干细胞的分化;并在此基础上首次尝试利用一种全新的“无支架细胞聚合体”的三维构建体系,体内异位构建具有完整复合结构的牙周组织,以期为组织工程化牙周组织的临床应用(如牙周病的正畸治疗、自体牙移植等)探寻一条新的研究途径。所取得的主要研究结果如下:1、根端牙胚细胞诱导牙周再生相关间充质干细胞分化的实验为了验证根端牙胚细胞所提供的发育期牙根/牙周组织微环境是否适合成体牙周膜干细胞/骨髓间充质干细胞的增殖、分化,本实验建立了根端牙胚细胞与牙周膜干细胞/骨髓间充质干细胞的间接共培养体系,观察根端牙胚细胞对牙周膜干细胞/骨髓间充质干细胞生物学活性的影响。结果显示:根端牙胚细胞条件培养液中包含的多种促增殖、分化的可溶性信号分子,能够有效诱导牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞分别向功能性成牙骨质细胞谱系和成骨细胞谱系分化,并在体内分别异位形成牙周膜/牙骨质复合体样结构以及骨样结构。本研究的结果充分说明,我们所设想的在牙周组织工程中以牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞为种子细胞,利用牙根/牙周发育学的机理来指导完整复合牙周结构构建的策略是切实可行的。2、新型细胞聚合体的构建及应用于牙周组织工程的研究本研究在充分借鉴细胞膜片技术的基础上,提出了一种全新的“无支架细胞聚合体”的牙周组织三维构建策略:先构建细胞-基质膜片;而后利用膜片体外容易聚合成团的特性建立高密度细胞聚合体的三维立体培养体系;最后对具备一定强度和厚度的不同类型细胞聚合体体外进行修整、塑形和叠加,构建包含牙周膜、牙槽骨、牙骨质在内的完整复合牙周结构。利用包含抗坏血酸的α-MEM培养基,体外扩增培养的牙周膜干细胞/骨髓间充质干细胞紧密结合、分泌基质,形成了具备一定强度和可操作性的细胞聚合体。将其单独或与支架复合进行体内移植的结果显示:单独的牙周膜干细胞聚合体无法生成牙周膜/牙骨质复合体样结构;根端牙胚细胞条件培养液诱导后的骨髓间充质干细胞聚合体形成了骨样结构;而经过根端牙胚细胞培养液诱导的牙周膜干细胞聚合体分别与CBB和牙本质片重组后均形成了形态上更加排列有序的牙周膜/牙骨质复合体样结构;牙周膜干细胞/骨髓间充质干细胞聚合体与牙本质片的重组体未能构建出完整复合牙周结构。本研究的结果说明,牙周膜干细胞聚合体利用细胞自身分泌的生物活性因子和细胞外基质建立局部微环境,再辅以根端牙胚细胞提供的生长因子微环境,最大限度地模拟了牙周组织形成过程中类似上皮根鞘和基底膜的作用。实验虽然未能按照预期设计最终构建出包含牙周膜、牙骨质、牙槽骨在内的完整复合牙周结构,但却初步验证了我们的构建策略具有一定的可行性,继续对其进行改进、完善将是我们今后的研究重点。