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八角是广西的特色香料植物,其被广泛应用于食品、医药等领域。本文从八角果、叶、枝等部位分离纯化八角内生真菌,对反式茴脑、肉桂醛以及苯乙酮等苯类香料进行了生物转化研究,主要研究内容和成果如下:1.八角内生真菌的分离、反式茴脑转化活性菌株的筛选和鉴定采用组织贴片平板培养的方法,从八角果、枝、叶中各分离获得24、32和23共79株内生真菌。利用微生物细胞生物转化方法,经底物耐受试验、TLC分析和HPLC分析,从79株内生真菌中筛选得到BGEF13和BJEF32,两菌株转化反式茴脑得到的产物分别为茴香醇和异香兰酸,形态学和分子生物学鉴定结果表明,BGEF13归属为稻黑孢菌Nigrospora oryzae,BJEF32 为可可毛色二孢菌Lasiodiplodiapseudotheobromae。2.八角内生真菌L.pseudotheobromae BJEF32转化反式茴脑合成异香兰酸采用单因素试验方法考察了转化条件和细胞培养条件对八角内生真菌L.pseudotheobromae BJEF32转化反式茴脑合成异香兰酸的影响。适宜的转化条件为:以0.05 mol·L-1 pH 7.0的Na2HP04-KH2P04缓冲溶液为反应介质,在100 mL三角瓶中,装液量为20 mL,菌体细胞浓度为50 g·L-1,底物反式茴脑浓度为1.48 g·L-1,辅助底物葡萄糖浓度为10 g·L-1,置于摇床中150 rpm、30℃转化48 h;适宜的细胞培养条件为:液体培养基中马铃薯浓度为250 g·L-1、葡萄糖浓度为20g·L-1、反式茴脑浓度为0.1 g·L-1,初始pH 7.0,装液量为100mL/250mL三角瓶,接种量为cφ6mm菌饼10个,接种后于28℃、150 rpm摇床培养96 h。在上述条件下,异香兰酸的产率为62%,转化液中异香兰酸的浓度达1.03 g·L-1。酶学实验和中间产物转化实验结果表明,八角内生真菌L.pseudotheobromae BJEF32转化反式茴脑合成异香兰酸的可能途径为:反式茴脑→反式茴脑环氧化物→反式茴脑二醇→茴香醛/茴香醇→茴香酸→异香兰酸。3.八角内生真菌N.oryzae.BGEF13转化反式茴脑合成茴香醇采用单因素试验方法优化八角内生真菌N.oryzae.BGEF13转化反式茴脑合成茴香醇的条件,得到转化条件为:以0.05 mo1·L-1 pH 6.0的Na2HP04-KH2P04缓冲溶液为反应介质,在100mL三角瓶中,装液量为40 mL,菌体细胞浓度为50 g·L-1,底物反式茴脑浓度为2.96 g·L-1,辅助底物葡萄糖浓度为10 g·L-1,置于摇床中120 rpm、30℃转化24 h;适宜的细胞培养条件为:液体培养基中马铃薯浓度为200 g·L-1、葡萄糖浓度为20g·L-1、蛋白胨浓度为2 g·L-1、反式茴脑浓度为0.1 g·L-1,初始pH 6.5,装液量为100 mL/250mL三角瓶,接种量为φ6mm菌饼10个,接种后于28℃、120 rpm摇床转速下培养96 h。在优化条件下,茴香醇的产率达42%左右,转化液中茴香醇的浓度达1.16 g·L-1。酶学实验和中间产物转化实验结果表明,八角内生真菌N.oryzae BGEF13转化反式茴脑合成茴香醇的可能途径为:反式茴脑→反式茴脑环氧化物→反式茴脑二醇→茴香醛→茴香醇/茴香酸。4.八角内生真菌催化苯乙酮还原合成手性化合物R-(+)-1-苯乙醇从八角内生真菌中筛选获得一株新壳梭孢菌Neofusicoccum parvum BYEF07,它能催化苯乙酮高选择性还原合成手性化合物1-苯乙醇,产物以R-(+)-1-苯乙醇为主。转化适宜条件为:以0.05 g·L-1 pH 7.5的Na2HP04-KH2P04缓冲溶液为反应介质,在100mL三角瓶中,装液量为40 mL,底物苯乙酮的浓度为1.8 g·L-1、菌体浓度为100 g·L-1、辅助底物葡萄糖浓度为10g·L-1、装液量为40ml/100mL三角瓶、摇床转速150rpm、反应温度为30℃、反应时间为48 h;细胞培养的适宜条件为:液体培养基中马铃薯浓度为250g·L-1、蔗糖浓度为20g·L-1、初始pH7.5、装液量为100 mL/250mL三角瓶、接种量为φ6mm菌饼12个,接种后于28℃、120rpm摇床培养120 h。在上述条件下,1-苯乙醇的摩尔转化产率达85%,转化液中1-苯乙醇的浓度达1.55·L-1,R-(+)构型的ee值可达99%。八角内生真菌N.parvum BYEF07细胞催化苯乙酮不对称还原生成1-苯乙醇的过程中存在底物抑制和产物抑制效应。采用Han-Levenspiel模型拟合得底物抑制反应模型中的各参数为:Vsm=0.082mmol·L-1·g-1·h-1,Ks=4.24 mmol·L-1,Sc=95 mmol·L-1 n=1.45;产物抑制反应模型中的各参数为:Vpm=0.051 mmol·L-1·g-1·h-1,Pc= 146 mmol·L-1,m=1.28。5.八角内生真菌催化肉桂醛加氢合成肉桂醇和3-苯丙醇从八角内生真菌中筛选得到塔宾曲霉Aspergillustubingensis BGEF03和葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea BGEF10,它们能选择性催化肉桂醛加氢生成肉桂醇和3-苯丙醇。AspergillustubingensisBGEF03转化肉桂醛合成肉桂醇的适宜反应条件为:以0.05 mol·L-1 pH 6.5的Na2HP04-KH2P04缓冲溶液作为反应介质,在100 mL三角瓶中的装液量为40 mL,底物浓度为1.5 g·L-1,菌体细胞浓度为50g·L-1 辅助底物葡萄糖浓度为10g·L-1摇床转速120rpm、25℃下转化24 h。在此条件下,肉桂醇的产率达58.5%,转化液中肉桂醇的浓度可达0.89 g·L-1,体系中未检测到3-苯丙醇。BotryosphaeriadothideaBGEF10催化肉桂醇加氢合成3-苯丙醇的适宜条件为:以0.05 mol·L-1 pH 7.0的Na2HP04-KH2P04缓冲溶液为反应介质,在100 mL三角瓶中装液量为40 mL,菌体细胞浓度为75 g·L-1,底物浓度为1.0 g·L-1,葡萄糖浓度为15 g·L-1,摇床转速150 rpm,温度30℃下转化72h。在此条件下,3-苯丙醇的产率达78.9%,而肉桂醇的产率仅为5.4%,反应体系中3-苯丙醇和肉桂醇的最终浓度分别为0.81 g·L-1和0.06 g·L-1。