论文部分内容阅读
目的：以癌干细胞的耐药特性为建立富集肝癌干细胞的切入点,在机体环境或干细胞培养微环境下,进行构建体外或体内的肝癌干细胞富集模式的实验研究。以此提高肝癌干细胞的比例,期望解决癌干细胞数量少而导致肝癌干细胞实验研究的“瓶颈”问题。方法：选取人肝癌BEL-7404细胞系为研究对象,采用体外与体内两种微环境,以化疗药物干预为基本手段,建立富集肝癌干细胞模式。主要构建模式如下：(1)体外肝癌干细胞富集模式：①体外长期化疗药物干预模式：即采用逐步递增化疗药物阿霉素浓度间歇作用的方法诱导肝癌细胞耐药,相当于诱导培养耐药肝癌细胞系,时间为8个月；②体外短期施加化疗药物干预模式：不同浓度阿霉素干预肝癌细胞,时间为4天；在体外长期与短期模式化疗药物干预后,均加入干细胞培养基培养环境中,进行以下生物学检测。(2)在体肝癌干细胞富集模式：建立肝癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,采用阿霉素(8mg/kg)与环磷酰胺(100mg/kg)干预,待肿瘤直径为1.5cm时取材原代培养,并在体内连续传代2-3次。肝癌干细胞富集模式的富集效率检测指标：①单细胞克隆形成实验；②平板克隆形成实验；③“球囊”培养情况,即干细胞培养基中球囊形成情况；④癌干细胞表面标志物CXCR4流式细胞术检测。结果：体外肝癌干细胞富集模式实验结果：①体外短期施加化疗药物干预模式结果：BEL-7404细胞体外克隆增殖能力强,单细胞克隆形成率、平板克隆形成率分别是(21.60±6.22)%和(161.25±18.30)‰,BEL-7404阿霉素短期干预细胞BEL-7404/ADM-S单细胞克隆形成率、平板克隆形成率分别是(3.13±0.75)%和(24.33±6.11)‰；②长期化疗药物干预模式：体外化疗药物低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成耐药肝癌细胞系BEL-7404/ADM(0.4μg/ml),耐药倍数达292倍,BEL-7404/ADM-L细胞能将ADM排出细胞外,但单细胞克隆形成率、平板克隆形成率比亲本细胞降低,分别是(0.02±0.01)%和(113.75±18.89)‰。BEL-7404细胞、BEL-7404/ADM-S.BEL-7404/ADM-L细胞在标准培养基下CXCR4的表达率分别是：(4.33±2.07)%,(0.73±0.33)%,(5.25±2.76)%,在干细胞培养基下CXCR4的表达率分别是：(23.84±6.90)％,(35.59±8.39)％,(28.41±15.61)％.BEL-7404、 BEL-7404/ADM-S.BEL-7404/ADM-L在低粘附孔板上用干细胞培养基培养时均不能形成球囊。③在体肝癌干细胞富集模式：将BEL-7404. BEL-7404/ADM-L分别接种于裸鼠,形成肝癌移植瘤体内连续传代并给予一定剂量化疗药物(阿霉素、环磷酰胺)干预所得富集后细胞,成瘤率100%。接种亲本细胞形成肝癌移植瘤组：经阿霉素干预后BEL-7404P1.BEL-7404P2细胞单细胞克隆形成率分别是：(16.00±1.41)％,(73.80±5.66)％,BEL-7404P1、BEL-7404P2细胞平板克隆形成率分别是：(31.00±14.14)‰,(98.00±16.97)‰。经环磷酰胺干预后BEL-7404P1、BEL-7404P2、BEL-7404P3细胞的单细胞克隆形成率分别是：(42.76±15.89)％,(42.13±3.38)％,(39.23±14.35)％,BEL-7404P1.BEL-7404P2.BEL-7404P3细胞的平板克隆形成率分别是：(266.50±6.40)‰,(478.00±18.06)‰,(557.25±13.10)‰。接种耐药细胞肝癌移植瘤组：经阿霉素干预后BEL-7404/ADM P1、 BEL-7404/ADM P2细胞单细胞克隆形成率分别是：(31.00±14.14)％,(98.00±16.97)％,BEL-7404/ADM P1.BEL-7404/ADM P2细胞平板克隆形成率分别是：(178.75±56.91)‰,(906.50±59.38)‰。经环磷酰胺干预后：BEL-7404/ADM P1、BEL-7404/ADMP2、BEL-7404/ADM P2细胞的单细胞克隆形成率分别是：(22.00±3.58)%,(33.22±13.66)%,(47.05±6.93)%, BEL-7404/ADMP1、 BEL-7404/ADMP2, BEL-7404/ADMP3细胞的平板克隆形成率分别是：(480.50±28.11)‰,(452.63±92.68)‰,(415.00±19.30)‰。接种亲本细胞形成肝癌移植瘤组：经阿霉素干预后BEL-7404P1、BEL-7404P2细胞CXCR4表达率分别是：(1.46±1.75)%,(0.50±0.09)%,经环磷酰胺干预后BEL-7404P、BEL-7404P2、 BEL-7404P3细胞的单细胞克隆形成率分别是：(2.78±3.35)%,(3.78±3.26)%,(2.06±0.77)%,接种耐药细胞肝癌移植瘤组：经阿霉素干预后BEL-7404/ADM P1、 BEL-7404/ADM P2细胞单细胞克隆形成率分别是：(2.94±3.34)%,(15.90±23.24)%,经环磷酰胺干预后：BEL-7404/ADM P1、 BEL-7404/ADM P2、BEL-7404/ADM P3细胞的单细胞克隆形成率分别是：(2.05±1.70)%,(24.38±0.35)%,(6.55±2.20)%,经阿霉素干预后BEL-7404/ADM P2细胞球囊形成率为：(11.27±4.43)%。结论：人肝癌BEL-7404细胞中出现了一部分具有癌干细胞特性的细胞。耐药细胞系接种形成裸鼠皮下移植瘤经阿霉素干预后,可以富集的细胞中具有癌干细胞特性的肝癌干细胞样细胞。通过检测并分析单一使用CXCR4并不适合作为新的肝癌干细胞阳性标记物。